Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

The genus Campylobacter is globally recognised as the leading bacterial cause of human foodborne gastroenteritis. Every year around 8000 Swedes are infected by Campylobacter. Most people are infected by thermotolerant Campylobacter species, commonly C. jejuni and C. coli. In this study a triplex real-time PCR has been developed in order to be a last step in a qualitative method for identification of thermotolerant Campylobacter, originating from food and water suspected to have caused human gastroenteritis. PCR is preceded by enrichment and isolation on selective medium and cultivation microaerophilically at 41.5 °C. The developed triplex real-time PCR was based on a combination of previously published primers and probes targeting the hipO, cadF, and 16S rRNA genes. In total 115 strains, representing 17 different Campylobacter species and additionally 10 non-Campylobacter species, genetically related to Campylobacter or commonly causing human gastroenteritis, were tested for inclusivity and exclusivity. Species-specific PCR products were produced to distinguish C. coli and C. jejuni. Thereto an amplicon of the 16S rRNA gene was produced for C. coli, C. jejuni, C. lari, two of seven C. upsaliensis, and C. insulaenigrae. No PCR product was obtained from any non-Campylobacter strains. Thereby, the method sufficiently met the needed requirements. The aim was also to compare two different methods for DNA extraction, where the InstaGene™ kit with a slight modification was preferred to simple boiling. Also the inhibition of the PCR assay if bacterial colonies were grown on blood agar or modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar (mCCDA) was compared, with no differences found between the culturing medias.

Om maten vi äter eller vattnet vi dricker inte har tillagats eller renats på rätt sätt kan det
orsaka matförgiftning. Den bakterie som oftast orsakar matförgiftning kallas
Campylobacter och varje år drabbas ca 8000 svenskar av Campylobacter. Bakterien finns
över hela världen och det räcker att man får i sig ett fåtal bakterier för att man ska bli sjuk.
Andra bakterier som ofta orsakar matförgiftning är salmonella, stafylokocker och kolera.
Även virus, svampar (mögel) och parasiter kan orsaka matförgiftning. År 2010 drabbades
till exempel dricksvattnet i Östersund av ett stort utbrott av parasiten Cryptosporidium och
över 20 000 personer blev sjuka. Vad gäller Campylobacter, som vi har studerat närmar i
denna studie, orsakar bakterien sällan stora utbrott. De vanligaste smittkällorna är rå
kyckling, opastöriserad mjölk och vatten från åar och bäckar som inte har renats. Drabbas
man av Campylobacter får man diarré, ont i magen, blir illamående och kräks. I sällsynta
fall kan man även drabbas av en förlamningssjukdom som kallas Gullain-Barré syndrom.
Det finns olika arter av Campylobacter, de som oftast drabbar människor kallas
Campylobacter jejuni som orsakar mellan 80 -85 % av fallen, följt av C. coli som är
upphov till ca 10-15 % av alla Campylobacter-utbrott. När människor drabbas av
matförgiftning och blir så sjuka att de måste uppsöka vård är det viktigt att ta reda på
vilken mikroorganism (bakterie, virus, svamp eller parasit) de drabbats av för att kunna
sätta in rätt behandling, t.ex. ge rätt antibiotika. Det är därmed nödvändigt att kunna skilja
mellan olika arter av Campylobacter.
Livsmedelsverket har i denna studie utvecklat en ny analysmetod för att på ett snabbare
och mer effektivt sätt ta reda på vilken art av Campylobacter som orsakat matförgiftning;
C. jejuni, C. coli eller andra så kallad termotoleranta Campylobacter. Kännetecknade för
termotoleranta Campylobcater är att de kan växa i temperaturer upp till 42 ºC och
begreppet inkluderar C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis and C. helveticus. Metoden
som har utvecklats kallas PCR (polymerase chain reaction) och har sin utgångspunkt i två
tidigare publicerade metoder som man nu slagit samman till en. Mekanismerna för PCR bygger på att man letar efter DNA från Campylobacter. DNA är den genetiska koden för
allt levande, våra arvsanlag och gener. I traditionella PCR-metoder detekterar man en gen, men unikt för denna nya metod är att man kan detektera tre gener samtidigt i samma
analys; en gen unik för C. jejuni, en för C. coli och en för termotoleranta Campylobacter.

Att söka efter flera gener samtidigt sparar tid och pengar.
För att testa hur effektiv metoden är analyserades 115 prov representerande olika
Campylobacter men även närbesläktade mikroorganismer och bakterier som ofta orsakar
matförgiftning. Metoden hittade alla C. jejuni och C. coli och fungerade perfekt för dessa
arter. Vad gäller den större spretiga gruppen termotoleranta Campylobacter hittade
metoden alla C. jejuni, C. coli och C. lari, två av sju C. upsaliensis och inte C. helveticus.
Att C. helveticus inte plockas upp ses inte som något större problem då den arten aldrig har
isolerats från människa och är därmed mycket osannolik att finna i livsmedel. Resultaten vi
fick för C. upsaliensis stämmer väl överens med de från tidigare studier och då bakterien
ytterst sällan orsakar matförgiftning ses det inte som något större problem att man inte
hittar alla C. upsaliensis. Viktigast att finna är C. jejuni och C. coli då de är de
Campylobacter som oftast orsakar matförgiftning hos människor, vilket metoden klarar
och syftet med studien anses därmed uppfyllt.
Genom att både ta prov från patienten och livsmedlet som man tror har orsakat
matförgiftningen och analysera dessa med Livsmedelsverkets metod kan man se om
provsvaren stämmer överens. Gör de det så vet man vilket livsmedel det var som orsakade
matförgiftningen. Oftast tar man in flera livsmedel för analys och letar efter flera olika
mikroorganismer. Hela analysmetoden tar dock ett par dagar och detta är något man kan
titta vidare på, hur man kan förkorta analystiden ytterligare för att få ännu snabbare svar.