Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Detta arbete syftade till att validera en metod för analys av interleukin-1 receptor antagonist (IL-1 RA) i plasma från häst. Med en fungerande analysmetod finns möjligheten att använda IL-1 RA som biomarkör för antiinflammatoriska effekter av läkemedel exempelvis dexametason.
En kommersiell ELISA framtagen för analys av IL-1 RA hos häst användes vid valideringen. Analysmetoden var tidigare endast validerad för analys av IL-1 RA i spädningsmedium från tillverkaren.
Vid validering av metoden framställdes standardkurvor i spädningsmedium från tillverkaren (reagent diluent=RD) samt i olika biologiska medier från häst. Beräkning av
standardkurvorna utfördes med hjälp av linjär regression och innefattade intervallet 0,313 – 20 ng/mL. R2-värden som erhölls för dessa kurvor var i RD: 0,9735 – 0,9961, i RD med
dubbel mängd antikroppar jämfört med tillverkarens rekommendationer: 0,9953, i plasma:
0,98, i obehandlat serum: 0,85 och i värmeinaktiverat serum: 0,01. Vid upprepade analyser av standardkurvor i hästplasma (n=6) hade fem av dessa standardkurvor ett R2-värde i medeltal på 0,978. Häst fyra analyserades två gånger och erhöll R2-värden 0,68 och 0,83.
Utbytet från plasma som spikades med IL-1 RA var lågt, 25 % vid 10 ng/ml och endast 2 % vid 2,5 ng/ml.
Metoden uppvisade stor variation i precision både vid analys i RD och i plasma. Repeterbarheten (%CV) beräknad på duplikat av IL-1 RA-koncentrationer från de olika
standardkurvorna var i RD (n=4) 2,7 – 37,5 % (0,313 ng/ml) och 0,1 -5,4 % (20 ng/ml), i RD med dubbel mängd antikroppar (n=1) var CV 79,6 % (0,313 ng/ml) och 1,6 % (20 ng/ml), i serum (n=1) 51 % (0,313 ng/ml) och 1,5 % (20 ng/ml) och i plasma (n=6) 2 -914 % (0,313 ng/ml) och 1-13 % (20 ng/ml). I plasma från häst var CV för repeterbarheten 1-16 % vid 5 ng/ml och inte godtagbar i lägre koncentrationer. Reproducerbarheten (% CV) i RD (n=4) var
105,5 % (0,313 ng/ml) och 5,2 % (20 ng/ml) och i plasma (n=6) 1308 % (0,313 ng/ml) och 6 % (20 ng/ml). Lägsta koncentration med godtagbar reproducerbarhet (CV=14 %) i plasma från häst var 5 ng/ml.
Metoden fungerade med godtagbar precision i RD med undantag av den lägsta koncentrationen i standardkurvan där både repeterbarhet och reproducerbarhet uppvisade stora variationer. En förklaring är att linjär regression användes för att beräkna standardkurvan vilket fram för allt innebar att den lägsta koncentrationen blev osäker.
Sammanfattningsvis kan inte denna analysmetod användas för undersökning av IL-1 RA koncentrationer i serum och plasma eftersom de lägsta mätbara koncentrationerna med
godtagbar precision var > 5 ng/ml. Problemet med metoden var att utbytet från plasma var lågt vilket innebär att den testade metoden blev okänslig och inte tillförlitlig för analys av IL-1 RA i hästplasma.

The aim of the study was to validate a commercial method for analyzing interleukin- 1 receptor antagonist (IL-1 RA) in equine plasma. A sensitive and reliable assay for IL-1 RA in serum and plasma might be used to evaluate the anti-inflammatory effect of pharmaceuticals such as dexamethasone.
A commercial ELISA, previously only validated by the manufacturer in dilution medium, was tested in different biological fluids from horses and validated for inter and intra assay variations.
Standard curves were tested in dilution medium from the manufacturer (reagent diluent=RD) and in the different biological fluids from horses. The standard curve was calculated using linear regression comprising the interval 0.313 – 20 ng/ml The correlation coefficient (R2) for these curves were: 0.9735 – 0.9961 for RD, 0,9953 for RD with twice the amount of antibodies compared with the manufacturer’s recommendations, 0.98 for plasma, 0.85 for
serum and 0.01 for serum heated to denature the proteins. At repeted analysis, standard curves in equine plasma (n=6) had mean R2-values of 0.978 in 5 and R2-values of 0.8 and
0.83 in one horse analyzed twice.
In plasma, spiked with IL-1 RA, the recovery of the substance was low, 25% at 10 ng/ml and only 2% at 2.5 ng/ml.
Concentrations retrieved in the tested assay showed great variation both in RD and plasma.
The intra assay coefficient of variation (%CV) calculated from duplicates of concentrations for IL-1 RA from the standard curves was 2.7 – 37.5 % (0.313 ng/ml) and 0.1 -5.4 % (20 ng/ml) in RD (n=4), CV was 79.6 % (0.313 ng/ml) and 1.6 % (20 ng/ml) in RD with twice the amount of antibodies compared to the manufacturer’s recommendations (n=1), 51 %
(0.313 ng/ml) and 1.5 % (20 ng/ml) in serum (n=1) and 2 - 914 % (0.313 ng/ml) and 1-13 % (20 ng/ml) in plasma (n=6). In plasma the intra assay coefficient of variation was 1-16 % at 5 ng/ml and unacceptable (>25%) at lower concentrations. The inter assay CV was 105.5 %
(0.313 ng/ml) and 5.2 % (20 ng/ml) in RD (n=4) and 1308 % (0.313 ng/ml) and 6 % (20 ng/ml) in plasma (n=6). The lowest concentration in plasma with an acceptable inter assay CV (14 %) was 5 ng/ml.
The main problem with the tested assay was the low sensitivity and repeatability rendering it
impossible to measure low concentrations of IL-1 RA in plasma, hence the anti-inflammatory effect of different steroid treatments could not be evaluated with the aid of this assay.