Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Bringing back the nutrients from the city to the country is becoming increasingly important, as the world’s stores of nutrients get more exhausted. Sewage sludge is an unapplied resource, rich in plant nutrients, which could replace parts of the commercial fertilizers used in Sweden
today. Sewage sludge may contain large amounts of pathogens, such as Campylobacter and Salmonella, why use can cause severe spreading of infections, both to animals and humans. These pathogens have the ability to survive for a long time in soil and water and therefore
some sort of treatment of the sludge is recommended before use. Sanitizing treatments used today includes pasteurisation, composting and addition of lime. These treatments are less suitable because of work environmental and economic reasons and therefore new methods are
evaluated.

One such method is ammonia sanitization. At higher pH the major part of the ammonia is in its uncharged form, NH3, which is the sanitizing agent, while at lower pH, it is ionised, NH4 +, and constitutes an important plant nutrient. Urea is the world’s most essential fertilizer and
when in contact with the enzyme urease it decomposes into ammonia. The addition of ammonia or urea increase the sludge’s value as a fertilizer, because of the higher amount of nitrogen incorporated.

Previous studies with ammonia sanitization in urine and faeces have shown effective inactivation of pathogens. The treatments consisted of additions of 0.5 - 2 % urea or ammonia at various temperatures (4-34°C), sanitizing the material from Salmonella, Enterococcus and Ascariseggs. Salmonella is the most studied organism in sewage sludge and may appear in concentrations of 107 colony forming units (CFU) /g dw sludge.

For analysis of the effectiveness of the sanitization, the presence of microorganisms is measured in the material before, during and after the treatment. This is usually done by culturing on agar, a method that is highly time-consuming (often 3 days are required). Since
the treatments are carried out in materials that are complex, it is difficult to find satisfactory
alternative methods. One method that may be used is amplified single-molecule analysis. This study is a comparison of the the agar culturing and amplified single-molecule analysis as well as a study of how effective ammonia sanitization is when sanitizing sewage sludge. Therefore the experiment was divided into two parts; one where sanitization was measured by culturing
Salmonella on agar and one where purified DNA from the samples were analysed with amplified single-molecule detection.

After addition of Salmonella to the sewage sludge, 2 % urea or 0.5 % ammonia was added and then the samples incubated in 24 or 14°C respectively. Samples were analysed on day 0,
1, 2, 5, 8, 12, 15 and 29. Both treatments resulted in efficient sanitization of the sewage sludge and riddance of Salmonella. For the urea treatment, 2 days were enough to achieve satisfactory reduction, while for ammonia, 10 days were sufficient.

In the part of the study with amplified single-molecule analysis, no bacteria were detected. The reason for this was that the padlock probes used did not fit the strain of Salmonella that was used. The method seems more suitable for analysis of more specific organisms, such as
EHEC, and more research must be done on padlock probes for the method to work satisfactorily.

Återföringen av näring från stad till land blir allt viktigare i och med att världens förråd av näringsämnen tar slut. Avloppsslam är en outnyttjad resurs, rik på växtnäringsämnen, som skulle kunna ersätta delar av det mineralgödsel som används i Sverige idag. Avloppsslam kan
dock innehålla stora mängder av sjukdomsframkallande mikroorganismer, t ex Campylobacter och Salmonella varför användning kan orsaka smittspridning både till djur
och människor. Eftersom dessa mikroorganismer överlever länge i jord och vatten rekommenderas någon form av behandling innan avloppsslammet sprids. Hygieniserande
behandlingar som används idag är bland andra pastörisering, kompostering och tillsatser av kalk. Dessa är av arbetsmiljömässiga och ekonomiska skäl mindre lämpliga varför nya metoder eftersträvas.

En sådan metod är ammoniakbehandling. Vid högt pH befinner sig den största delen av ammoniaken i sin oladdade form, NH3, som är den som verkar hygieniserande, medan vid ett
lägre pH så är den laddad, NH4 +, och utgör ett viktigt växtnäringsämne. Urea är världens vanligaste försålda gödselmedel och i kontakt med enzymet ureas så sönderfaller det till ammoniak. Vid tillsats av ammoniak eller urea stiger materialets gödselvärde eftersom kväve har tillförts.

Tidigare försök i urin och fekalier har visat en effektiv avdödning av patogener med ammoniakhygienisering. Behandlingarna har utgjorts av tillsatser med 0,5-2 % urea eller ammoniak vid olika temperaturer (4-34°C) och har testats på tillsatser av Salmonella, enterococker och ascarisägg. Salmonella är den organism som är mest studerad i avloppsslam och har visat sig kunna uppnå en koncentration på 107 koloniformande enheter (CFU)/g ts
slam.

Vid analyser av hygienisering mäts förekomsten av mikroorganismer i materialet innan, under och efter behandlingen. Detta sker oftast genom odling på agarplattor, en metod som är tämligen tidskrävande (3 dygn krävs ofta). Eftersom behandlingarna utförs i material som är komplexa är det svårt att hitta alternativa metoder, men en metod som kan vara aktuell är amplifierad singelmolekylanalys. I denna studie jämfördes amplifierad singelmolekyl analys med odling på agarplattor parallellt med att effekten av hygieniseringen mättes. Därför
delades försöket upp i två delar, en där hygieniseringen mättes genom att odla Salmonella på agarplattor och en där DNA renades fram ur proverna och som det sedan utfördes amplifierad singelmolekylanalys på.

Efter att Salmonella tillsatts avlopsslammet fick bakterierna adaptera till materialet innan 2 %
urea alternativt 0,5 % ammoniak tillsattes och proverna inkuberades proverna i 24 respektive 14°C. Proverna analyserades dag 0, 1, 2, 5, 8, 12, 15 och 29. Båda behandlingarna gav effektiv avdödning av Salmonella. För urean räckte 2 dygns behandling för att uppnå tillfredsställande reduktion, medan för ammoniaken tog det 10 dygn.

I försöket med amplifierad singelmolekylanalys detekterades inga bakterier med anledning av att de hänglåsprober som användes inte passade den stam av Salmonella som användes.
Metoden lämpar sig bättre för mer specifika organismer, som till exempel EHEC och mer forskning måste göras på hänglåsprober för att metoden ska fungera tillfredsställande.