Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Epididymal sperm are a potential resource enabling the preservation of valuable genes in populations where collection of ejaculated semen is not possible. There are many suggested methods on how to extract epididymal sperm, although comparison of some of these and establishment of a gold standard method have not been thoroughly studied – especially not in bovines. In this study the aim was to evaluate and compare two of the most used extraction methods in bulls, evaluating sperm quality characteristics to establish which method is to be preferred. The material used, consisting of pairs of bull testes, was provided by a local abattoir, and the extraction, as well as the initial analysis before cryopreservation, was executed the same day. The sperm collected using the cutting method (A), where incisions are made into the caudae epididymidis and the exuding sperm suspension is collected, had a significantly lower total and progressive motility than the vas deferens retrograde flushing method (B) prior to cryopreservation. This difference also applied to the kinematic parameters curvilinear velocity, straight line velocity, average path velocity and amplitude of lateral head displacement, as assessed by computer assisted sperm analysis (CASA). Another important aspect favoring Method B is that it exhibited a trend towards significance regarding a higher number of spermatozoa obtained, a desirable property when aiming to extract epididymal sperm from genetically valuable individuals.
Regarding the flow cytometry analyses plasma membrane integrity, reactive oxygen species and sperm chromatin structure, no differences were detected between the methods. Following the first analyses the samples were cryopreserved and subsequently analysed again after thawing. There were multiple differences between the samples prior to cryopreservation and post-thawing, showing a decrease in characteristics post-thawing for all quality analyses except for the chromatin structure and the reactive oxygen parameter Live SO+. No significant differences or correlations were found in sperm characteristics between the left and right testes, or between scrotal and testicular circumference. A weak correlation with age was, however, discovered implying that older bulls have better sperm motility and viability; the presence of testicular adhesions was associated with impaired sperm quality. All in all, this implies that the retrograde flushing method is to be preferred when extracting epididymal sperm, to acquire a higher total number of motile sperm in the fresh sperm sample. Regarding cryopreservation, a different protocol should be evaluated to achieve better post-thaw sperm quality. One should also bear in mind that sperm quality in younger bulls might not be as good as in slightly older ones.

Bitestikelspermier är en potentiell resurs som kan möjliggöra bevarandet av värdefullt genetiskt material i populationer där uppsamling av ejakulat inte är möjligt. Det finns flera föreslagna metoder för hur extraktionen av bitestikelspermier bör gå till, men jämförelse av metoderna har inte utförts i någon omfattande utsträckning hos oxdjur. Etablering av en gold standardmetod har således uteblivit. Denna studies syfte är att utröna och jämföra hur två av de vanligast förekommande metoderna påverkar spermiekvaliteten hos tjurar för att därefter kunna fastställa vilken metod som är att föredra. Materialet bestående av tjurtestiklar tillhandahölls av ett lokalt slakteri och spermi-extraktion likväl som initial analys av proverna innan nedfrysning utfördes samma dag. Metoden innefattade anläggande av snitt i cauda epididymidis (A) följt av aspiration av framläckande spermiesuspension innebar signifikant lägre totalt och progressiv motilitet hos spermierna före nedfrysning jämfört med metoden där spermier retrogradt spolas genom vas deferens (B). Denna skillnad gällde även parametrarna ”curvilinear velocity”, ”straight line velocity”, ”average path velocity” och ”amplitude of lateral head displacement” som beräknats med hjälp av datorassisterad spermieanalys (CASA). En annan viktig aspekt som talar för att Metod B är att föredra är att den uppvisade en trend mot signifikans gällande större antal extraherade spermier vilket är en mycket önskvärd egenskap vid extraktion av bitestikelspermier från genetiskt viktiga individer.
För analyserna utförda med flödescytometri inkluderande membranintegritet, reaktiva syre-föreningar och kromatinstruktur kunde ingen signifikant skillnad identifieras metoderna emellan. Efter den första analysen kryopreserverades proverna och upprepande analys utfördes efter upptining. Det fanns flera skillnader mellan proverna innan frysning och efter upptining, som tillsammans tydde på sämre spermiekvalitet efter upptining. Detta omfattade samtliga kvalitets-analyser förutom kromatinstruktur och parametern Live SO+ inom analysen för reaktiva syre-föreningar. Spermiekvaliteten hos proverna jämfördes även avseende vänster och höger testikel samt för skrotal och testikulär omkrets utan att någon signifikant skillnad eller korrelation kunde identifieras. En svag korrelation hittades dock med antydan att äldre tjurar har bättre spermie-motilitet och viabilitet, samt att en signifikant skillnad kunde fastställas där förekomst av tesikulära adherenser innebar en sämre spermiekvalitet. Sammantaget tyder detta på att extraktionsmetoden där spermier utvinns genom retrograd genomspolning är att föredra vid extraktion av bitestikel-spermier för att förvärva en högre motilitet i färska spermieprov. Angående nedfrysningen bör ett annat protokoll utvärderas för att uppnå en bättre spermiekvalitet efter upptining. Man bör också ha i åtanke att yngre tjurar kanske inte bidrar med lika god spermiekvalitet som de något äldre tjurarna.