Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Kojuvret har under lång tid betraktats som ett sterilt organ. Resultat från analyser med moderna metoder som polymerase chain reaction (PCR) och DNA-sekvensering har lett till teorin om att det finns en normal mikrobiota i mjölk och att den har ett endogent ursprung. Studier har visat att mikrobiotan består av låga koncentrationer både grampositiva och gramnegativa bakterier, däribland mjölksyrabakterier (LAB). Dessa är en heterogen grupp bakterier med antibakteriella och probiotiska egenskaper vilka kan ha positiv betydelse för juverhälsan och kons immunförsvar i samband med mastit. Mikrobiotans diversitet har visats vara större i friska juverdelar jämfört med mastitdrabbade och vissa studier visar på permanenta förändringar medan andra pekar på att mikrobiotan har förmåga att återhämta sig oberoende av antibiotikabehandling. Preliminära data från en ännu ej publicerad studie vid institutionen för husdjurens utfodring och vård (HUV) på Sveriges lantbruktsuniversitet (SLU) tyder på en minskad förekomst av LAB i mjölk i samband med en experimentellt inducerad mastit. Data indikerar också att sammansättningen av LAB 14 dagar efter mastitinduktionen inte är densamma som innan men mer forskning på området behövs.Syftet med studien var att undersöka hur förekomsten av LAB i mjölk förändras över tid efter en intramammär infusion med lipopolysackarid (LPS) från Escherhichia coli i en spene vardera hos fem mjölkkor av raserna Svensk låglandsboskap (SLB) och Svensk röd och vit boskap (SRB). Odling på blodagar, de Man Rogosa and Sharpe agar (MRS-agar) och typning med Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry (MS) har använts för att identifiera arter av LAB och koncentrationer av LAB över tid har analyserats med droplet digital PCR (ddPCR). Ytterligare ett syfte var att utvärdera endotoxinmodellens förmåga att experimentellt inducera mastit.Mjölkprov togs från tio friska lakterande kor på Lövsta forskningscentrum och undersöktes avseende somatiskt celltal (SCC), LAB-koncentration och bakterieinnehåll. Fem kor infuserades med LPS och fem infuserades med NaCl (kontroller) i en spene per ko. Mjölkprover togs vid flera tidpunkter innan och upp till 14 dagar efter infusion. På dagen för infusion bedömdes även kornas kliniska respons på infusion i form av kroppstemperatur, inflammationsskattning och smärtuttryck vid ett antal tidpunkter.Den kliniska responsen på infusion skilde sig signifikant mellan LPS-infuserade kor och kontrollkor vid ett antal tidpunkter efter infusion. Celltalen var signifikant högre hos LPS-infuserade kor från två timmar (p<0,001) fram till och med fem dagar (p<0,001) efter infusion. Kroppstemperaturen var signifikant högre hos LPS-infuserade kor från två (p<0,001) fram till och med sju timmar (p=0,004) efter infusion och tecken på lokal inflammation var signifikant tydligare från två (p=0,009) till fem dagar (p=0,048) efter infusion. Tydliga smärtsymptom förekom endast hos LPS-infuserade kor.Av samtliga mjölkprover resulterade 25% i bakterieväxt på blodagar och 50% i bakterieväxt på MRS-agar men samband mellan förekomst av bakterieväxt och tidpunkt kunde inte ses. Från MRS-agar isolerades kolonier för typning med MALDI-TOF MS men endast ett fåtal identifierades som LAB (streptokocker, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus casseliflavis, E. faecalis, E. faecium och Lactobacillus reuteri) och var inte överrepresenterade vid några särskilda tidpunkter eller i någon av kogrupperna. Resterande prover identifierades framförallt som stafylokocker eller kunde inte identifieras av instrumentet. Resultaten från ddPCR-analysen tyder på att koncentrationen LAB är högst från fyra timmar till fem dagar efter infusion vilket inte var förväntat. Misstanke om falska positiva resultat till följd av bindning av fluoroforen EvaGreen till DNA från neutrofiler i mjölken bekräftades som en trolig orsak i uppföljandeförsök utanför studiens ramar. Av denna anledning kunde inga slutsatser om koncentrationsförändringen av LAB över tid i samband med mastit dras.Resultaten från studien visar att experimentellt LPS-inducerad mastit är en väl fungerande och tillförlitlig modell i syfte att undersöka systemiska och lokala förändringar juvret i samband med mastit. De visar också att LPS-infuserade kor uttrycker tydlig smärta. Det går dessvärre inte att dra några slutsatser om förekomsten av LAB eller mikrobiotans dynamik i samband med mastit på grund av metodologiska problem.