Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Den vanligaste orsaken till att hästägare söker veterinärvård i Sverige är skador och sjukdomar i hästens rörelseapparat. Den vanligaste prestationshämmande
sjukdomen hos tävlingshästar är osteoartrit (OA). För att kunna häva sjukdomsförloppet vid OA krävs att en tidig detektion av sjukdomen görs, innan skadorna på leden har blivit irreversibla. Därför är det av yttersta vikt att hitta ett diagnostiskt hjälpmedel som förmår detektera OA i de tidigaste stadierna. Biomarkörer skulle kunna vara ett sådant hjälpmedel och cellytemolekylen CD163, som ses på M2 makrofagerna, tros vara en sådan markör för OA hos människa.

Syftet med detta examensarbete var att med hjälp av immunocytokemi utveckla en metod för att undersöka förekomsten av CD163-positiva celler i ledvätska från häst.
För detektion av CD163-positiva celler i ledvätska användes immunocytokemi och för detektion i ledkapsel användes immunohistokemi. Två olika antikroppar riktade mot humant CD163 testades och resultat från olika typer av fixering, förbehandling av preparaten och olika antikroppskoncentrationer utvärderades.

Totalt ingick sju ledvätskeprover från sex hästar och en ledkapselbiopsi i studien, varav fem ledvätskeprover härrörde från artroskoperade hästleder där ledskadorna
var makroskopiskt bedömda.

CD163-positiva celler kunde påvisas med antikroppen från R&D Systems i såväl ledvätskeprover som ledkapsel. Bäst resultat för infärgning av celler erhölls efter
formalinfixering och förbehandling med värmebad och en kommersiell ”antigenretrieval”-lösning. Förbehandling medförde att en lägre koncentration av antikroppen kunde användas och en tydlig infärgning av cellerna erhölls. Det låga antalet individer inkluderade i studien samt avsaknaden av prover från friska hästleder medförde att inga slutsatser beträffande antalet CD163-positiva celler i ledvätska vid olika typer av ledskador kunde utvärderas. Den framtagna metoden för påvisandet av CD163-positiva celler i ledvätskan möjliggör fortsatta studier för undersökning av förekomst av denna typ av celler vid olika typer av ledskador, och utvärdering av desamma som biomarkör för OA hos häst.

The most common reason for horses to be presented for veterinary care in Sweden is injuries affecting their locomotor system. The most common performance inhibiting disease in horses is osteoarthritis (OA). An early detection of OA is required in order to reverse the progression before the structural damage in the joint has become irreversible. It is therefore of great importance to find a diagnostic tool that enables detection of OA in its early stages. Biomarkers could be such a tool, and the cell surface molecule CD163, found on M2 macrophages, is believed to be a biomarker for OA in humans. The purpose of this study was to establish a method for detection of CD163-positive cells in synovial fluid and joint capsule from horses.

Immunocytochemistry and immunohistochemistry were used in order to detect CD163-positive cells in synovial fluid and joint capsule, respectively. Two different primary antibodies against human CD163 were used, and different methods for fixation and antigen retrieval, as well as the use of different antibody concentrations were evaluated.

In total seven samples of synovial fluid from six horses and one joint capsule biopsy were included in the study. Five synovial fluid samples originated from joints that had macroscopically been examined and evaluated during arthroscopy.

CD163-positive cells were detected with the antibody from R&D Systems in synovial fluid sample as well as in the joint capsule. The best immunostaining result were obtained when cytospin preparations from synovial fluid were fixed in formalin and pretreated with heated water bath and a commercial antigen retrieval solution. Pretreatment resulted in usage of lower concentration of antibody and a distinct staining of the cells was obtained. Due to the low number of horses included in the study and the lack of samples from healthy joints conclusions regarding numbers of CD163-positive cells in synovial fluid with different types of joint injuries could not be made.

The method established in this study makes it possible to perform further studies of the presence of CD163-positive cells in equine synovial fluid in different types of joint injuries and evaluation of CD163-positive cells as a biomarker of OA in horses.