Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Kennelhosta är ett samlingsnamn för en grupp virus- och bakterieinfektioner som ofta drabbar hundar som är tillsammans med större grupper av andra hundar. Symptomen är oftast milda, vanligtvis med en torr, hackande hosta, men kan i vissa fall ta sig uttryck som svårare symptom som lunginflammation. De vanligaste infektionsämnena är hundens parainfluensavirus (CPIV), hundens respiratoriska coronavirus (CRCoV), hundens adenovirus typ 2 (CAV-2) och bakterien Bordetella bronchiseptica. Hundens respiratoriska coronavirus är det virus som undersöktes i studien som ligger till grund för den här rapporten. Familjen coronavirus innehåller de största membranomslutna virusen med RNA som arvsmassa med genomstorlekar på upp till 32000 baser. Dess medlemmar har en gemensam genomstruktur med två stora öppna läsramar (ORF:s) i sin 5’-ände och gener som kodar för strukturella protein, det vill säga protein som bygger upp viruskapsiden, i 3’-änden i ordningen S – E – M – N där S är ett spikprotein, E är ett höljeprotein, M är ett membranprotein och N är ett nukleoprotein. Mellan dessa proteiner finns ofta olika mindre protein som inte är gemensamma för hela familjen, varav ett är ett influensa-likt hemagglutinin-esteras.
I studien som ligger till grund för den här rapporten undersöktes sekvensen som kodar för tre strukturella protein hos hundens respiratoriska coronavirus; spikproteinet, membranproteinet och hemagglutinin-esteraset. Hundens respiratoriska coronavirus (CRCoV) tillhör underfamiljen betacoronavirus som också innehåller bland annat nötboskapens coronavirus, människans coronavirus OC43, musens hepatitvirus och hästens coronavirus. Fylogenetiska undersökningar gjordes där CRCoV jämfördes med andra betacoronavirus, samt de tio specifika prover som tagits i Sverige. Ytterligare jämförelser gjordes även mellan andra sekvenser från tidigare studier av CRCoV runtom i världen (Korea, Storbritannien, Italien och Japan).
Det laborativa arbetet bestod i att till en början syntetisera cDNA från RNA som extraherats från nos- och svalgsvabbar från hundar som besökt utvalda veterinärkliniker runtom i landet och som visats vara PCR-positiva för CRCoV. cDNA:t användes sedan som templat för PCR-amplifikation av den virala arvsmassan och efter gelelektrofores, antingen enbart för att fastslå att PCR-reaktionen var lyckad eller för att också i vissa fall gelrena PCR-produkten, skickades PCR-produkterna för sekvensering. Primerpar användes för totalt sex genfragment, hemagglutinin-esterasgenen, membranproteingenen och fyra fragment för spikproteingenen. Antalet sekvenser per prov blev varierat; i vissa prover blev samtliga fragment sekvenserade och i andra bara några få fragment. Två prover gav aldrig några PCR-produkter över huvudtaget.
De CRCoV-genom som undersöktes verkade intressant nog ligga närmast ett isolat från en hund i Japan. Det är intressant eftersom sekvenser från virus isolat i England, som geografiskt ligger betydligt närmare, var förhållandevis långt bort från de svenska proverna rent fylogenetiskt. Även sekvenser tagna från coronavirus från svenska kor låg långt bort i trädet vilket borde betyda att det är osannolikt att det CRCoV som finns endemiskt i svenska hundar kommer från en separat överföring från svenska kor utan snarare antingen från andra hundar som besökt Sverige eller från utländska hundar som importerats till Sverige.

Kennel cough is a disease complex caused by several different pathogens, both viruses and bacteria. Most commonly, kennel cough presents with very mild clinical signs but occasionally more severe signs like bronchopneumonia can erupt. Kennel cough is caused by one of five pathogens; canine parainfluenzavirus (CPIV), canine respiratory coronavirus (CRCoV), canine adenovirus type-2 (CAV-2), canine influenzavirus (CIV) and the bacterial pathogen Bordetella bronchiseptica. This study focused on the genetic characterization of field isolates of CRCoV.
The coronavirus family contains the largest known enveloped RNA viruses with genome sizes ranging from 28kb to 32kb. Its members share a common genome structure with two large open reading frames in the 5’-end and the genes coding for structural proteins lumped together in the 3’-end. There is a conserved order in the four shared structural proteins; 5’ – S – E – M – N – 3’, where S is the spike protein, E is an envelope protein, M a small membrane protein and N is a nucleoprotein. A large and diverse group of smaller proteins have been observed in many of the coronaviruses and these differ from species to species. An example of this is the influenza-like hemagglutinin-esterase found on the surface of coronaviruses of the betacoronavirus subfamily. In this study, the nucleotide sequence of three of the structural protein genes found in the CRCoV genome was examined. CRCoV belongs to the betacoronavirus subfamily which also contains bovine coronavirus, human coronavirus OC43, murine hepatitis virus (MHV) and equine coronavirus, among other species. Phylogenetic analyses were conducted, both on CRCoV sequences in relation to the other coronaviruses and in relation to available CRCoV sequences from different countries (Korea, The United Kingdom, Italy and Japan).
The laboratory work consisted of four major steps. First cDNA was synthesized from RNA extracted from samples taken from nasopharyngeal swabs from dogs admitted at veterinary clinics from around Sweden and proven to be PCR-positive for CRCoV. Then the cDNA was used as template for PCR-amplification and the PCR products were analysed using gel electrophoresis. Some samples needed to be purified and these were purified by running all the PCR-product for that sample on a separate gel. The bands were then cut out with a scalpel and DNA was extracted using a gel purification kit. Sanger sequencing was done by MacroGen at their facility in Amsterdam. The sequences were quality controlled, trimmed and assembled using CodonCode Aligner and the phylogenetic trees were constructed using the PHYLIP neighbour joining algorithms with 1000x Bootstrap in the Ugene (Unipro) software. All phylogenetic trees were constructed using FigTree.
The CRCoV sequences that were analysed for phylogeny with the rest of the betacoronavirus family were most closely related to an isolate from a Japanese dog, which is interesting considering that samples taken geographically closer to Sweden were included. Sequences taken from Swedish cattle (bovine coronavirus) were also considerably distant, genetically, even compared to other BCoV sequences. The most reasonable conclusion is that the CRCoV strains found in Sweden most likely entered the Swedish dog population either through dogs traveling in and out of Sweden or through international pet trade as opposed to from a separate cross-over event from bovine coronavirus found in Swedish cattle.