Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Fertility is of central interest in the dairy production but has during the last decades declined. Increased milk yield has resulted in high pressure on the metabolism of the dairy cows that are supposed to manage the transition from dry cows to lactating cows within a few weeks around the parturition. Much indicate that metabolism and fertility are closely linked, with insulin playing a substantial part. There are many studies suggesting that the main part of gestation loss can be found during the early embryo development, a period which can be studied in vitro. The aim of this study was to test the effect of insulin during maturation in vitro and to evaluate two different fluorescent stainings on oocytes and embryos; a nuclear stain and a staining of apoptotic cells through the terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)-method.
Bovine cumulus-oocyte-complexes (n=991) were aspirated from abattoir-derived ovaries. The oocytes were matured in vitro under different insulin-conditions (Z: 0 μg/ml L: 0.1 μg/ml H: 10 μg/ml). After maturation, oocytes were either removed for staining or fertilized and cultured in vitro to day eight after fertilization. All blastocysts were morphologically assessed at day seven and eight. Cumulus-oocyte-complexes removed before fertilization and day eight blastocysts were later stained with TUNEL- and nuclear stain for evaluation. Statistical analysis was executed on arc sinus squareroot transformed values. The effect of treatments were analysed by ANOVA.
132 matured oocytes and 230 day eight blastocysts from eight batches were analysed. There was no significant difference between the treatments regarding oocytes cleaved 44h post fertilization (Z:0.85±0.02 L: 0.85±0.02 H: 0.89±0.03, p>0.05). Insulin tended to impair the fraction of blastocysts developed on day seven from cleaved oocytes (Z: 0.22±0.02 L: 0.17±0.02 H: 0.14±0.02, p=0.05). There was a tendency for insulin treated groups to have more of the earlier development stages and also less blastocysts of high quality grades when morphologically assessed at day eight compared to control group. The difference was significant when comparing treated groups together versus the control group (p<0.05). There was no significant difference in apoptotic cells in the blastocysts (Z: 0.021±0.003 L: 0.026±0.003 H: 0.028±0.003) nor in apoptotic cells in the outer two layers of the cumulus-complexes (Z: 0.052±0.025 L: 0.039±0.016 H: 0.077±0.044).
In this study, insulin during oocyte maturation in vitro impaired the blastocyst development both regarding fraction, stage and grade at day seven and eight. The TUNEL-kit evaluated did not work satisfactory for staining of embryos and cumulus-oocyte-complexes with multiple cell-layers. The nuclear staining tested however, seem to be a good candidate for staining of blastocysts and cumulus-oocyte-complexes with a limited amount of cell-layers. The stain is easy to use and further did not bleach after several weeks of storage.

Fertiliteten är essentiell i mjölkproduktionen men har under de sista decennierna minskat. Den ökade mjölkproduktionen sätter hög press på mjölkkons metabolism då hon förväntas ställa om från sinko till högmjölkande ko på ett fåtal veckor kring kalvning. Mycket pekar på att anledningen till den nedsatta fertiliteten hos mjölkkorna härör från metabolismen, där insulin har en betydande roll. Många studier visar också på hur majoriteten av dräktighetsförlusterna sker under den tidiga embryoutvecklingen, vilket är en period som kan simuleras in vitro, det vill säga i laboratoriemiljö. Syftet med denna studie var att testa insulinets påverkan på mognad av äggceller in vitro samt att utvärdera en metod för infärgning av kärnor och en annan metod för apoptotiska celler i äggceller och tidiga embryon.
Äggceller omgivna av stödceller (n=991) från nötkreatur samlades från äggstockar hämtade från slakteri. Äggcellerna fick mogna i tre olika insulinkoncentrationer in vitro (Z: 0 μg/ml L: 0,1 μg/ml H: 10 μg/ml). Efter mognad in vitro, avlägsnades antingen äggcellerna för färgning eller fick fortsätta in vitro produktionen genom befruktning och odling upp till dag åtta efter befruktningen. Äggcellkomplex som avlägnats före befruktningen samt blastocyster (tidiga embryon) från dag åtta färgades därefter med en kärnfärgning och en TUNEL-färgning för att detektera apoptos. Statistisk analys av resultaten utfördes av ANOVA, med arc sinus kvadratrot-transformerade värden.
Mognade äggcellskomplex (n=132) och blastocyster (n=230) från åtta omgångar ingick i studien. Det var ingen signifikant skillnad mellan de olika grupperna avseende äggceller som delat sig 44 timmar efter befruktningen (Z:0,85±0,02 L: 0,85±0,02 H: 0,89±0,03, p>0,05). Insulin tenderade att ha en negativ effekt på blastocystutvecklingen, med signifikanta värden vid dag sju-blastocyster räknat från antalet äggceller som delat sig 44 timmar efter befruktningen (Z: 0,22±0,02 L: 0,17±0,02 H: 0,14±0,02, p=0,05).
Det fanns en tendens att insulin även bromsade utvecklingen och försämrade kvaliteten av bildade blastocyster: Denna skillnad var signifikant vid jämförelse mellan insulin-behandlade grupper mot kontrollgruppen (p<0,05). Ingen skillnad kunde ses på andelen apoptotiska celler i blastocyster (Z: 0,021±0,003 L: 0,026±0,003 H: 0,028±0,003) eller i apoptotiska celler i de yttersta två lagren av cumuluskomplexen (Z: 0,052±0,025 L: 0,039±0,016 H: 0,077±0,044).
Denna studie visar hur insulin under äggcellens mognad in vitro påverkar embryoutvecklingen negativt, något som överensstämmer med tidigare studier. Tidigare studier har dock till viss del visat motsatta resultat avseende den negativa effekt av insulin som kunde ses på utvecklingsstadie och kvalitet i denna studie. TUNEL-färgningen som utvärderades i studien hade inte tillräckliga egenskaper för användning på embryon och äggcellskomplex, däremot visade kärnfärgningen goda egenskaper vilken gör den tillfredsställande i användning på embryon och äggcellskomplex.