Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Atopic dermatitis (AD) is a complex, often lifelong allergic disease affecting around 10 % of both
dogs and humans. The hallmark symptom is severe pruritus, causing a lowered quality of life. Mast
cells (MCs) are known to play an important part of the immunopathogenesis, promoting a faulty T
helper cell type 2 (Th-2) response which follows by a production of specific immunoglobulin E
(IgE) antibodies towards environmental allergens (Ag). To further investigate the role of MCs and
its mediators in the progression of AD, a low-calcemic vitamin D3 analog (MC903) was used to
induce AD-like symptoms locally on the ears of two different knock-out (KO) mouse strains. The
first strain was Wsh-/- mice deficient in MCs. The second strain was mice deficient in mouse mast
cell protease 4 (mMCP-4-/-), a homolog to the human and canine MC chymase (MCC).
The hypothesis was to observe an increase in inflammatory parameters following MC903-treatment,
such as migration of inflammatory cells, higher amount of inflammatory mediators and clinically
observed ear thickening. Thereby, MC903 would be proven to induce a functioning AD animal
model. The results showed that daily topical MC903 application on the left ear induced changes
mimicking AD macroscopically, microscopically and biochemically, including a Th-2 response
represented by associated cytokines. No changes were seen in the vehicle-treated ears (treated with
ethanol) used as an internal control.
The epithelial cell-derived thymic stromal lymphopoietin (TSLP) appeared to be an important
cytokine in promoting the skin inflammation since the amount of TSLP was markedly high locally
in the MC903-treated ears. In MC-deficient mice, TSLP-levels were significantly lower, thus
implicating a central role of MCs in this model. Although the presence of MCs caused higher levels
of both TSLP and interleukin 33 (IL-33) after MC903-treatment, the clinical appearance in Wsh+/-
mice was milder compared to mice lacking MCs. This indicates that MCs do promote the AD-like
skin inflammation caused by MC903, but at the same time prohibit the inflammation from being too
excessive.
The results from a small in vitro study performed as a part of this study, proved that MC903 also
activates MCs directly to degranulate. The MCC homolog mMCP-4 did on the contrary only
contribute to the lowering of IL-33 levels, most likely through cleavage of the cytokine by mMCP-
4, therefore no apparent role of MCC could be observed. In the cleavage study of TSLP, a more
rapid cleavage of TSLP was mediated by tryptase than chymase. Thus, as a continuation of this
study, the investigation of the role of tryptase in the MC903-induced AD-model would be of high
interest.
In conclusion, MC903 application induced an AD-like local inflammation, thus showing that the
method provides a functioning AD-model. MCs contribute to disease progression through cytokine
production, but have at the same time a limiting role in the course of inflammation.

Atopisk dermatit (AD) är en komplex och ofta livslång allergisk sjukdom som drabbar ca 10 % av
alla människor och hundar. Svår klåda kännetecknar sjukdomen, vilket medför en försämrad
livskvalitet för drabbade individer. Det är känt att mastceller (MC) är viktiga i immunopatogenesen,
då de bidrar till att skapa ett onormalt immunsvar med typ 2 T-hjälparceller (Th-2). Dessa är
förknippade med produktionen av immunoglobulin E (IgE) antikroppar mot allergen i omgivningen.
I detta försök användes en vitamin D3-analog (MC903) för att inducera AD-liknande symtom lokalt
på öronen, tillhörande två olika knock-out (KO) musstammar. Detta gjordes för att ytterligare
undersöka hur MC och dess mediatorer kan bidra i sjukdomsutvecklingen av AD. Den ena KO
musstammen (Wsh-/-) saknar MC och den andra KO musstammen saknar mastcellsproteas 4
(mMCP-4-/-), en mushomolog till mastcellsproteaset kymas (MCC) hos människa och hund.
Hypotesen i försöket var att lokalbehandling med MC903 skulle öka de inflammationsparametrar
som valts att studera i studien (klinisk sjukdomsutveckling, migration av inflammatoriska celler,
mängd av inflammatoriska mediatorer), vilket skulle bevisa att MC903 skapar en funktionell ADmodell.
Resultatet i studien visade att en upprepad applikation av MC903 på ena örat inducerade
förändringar som liknar dem som ses vid naturligt förekommande AD, både makroskopiskt och
mikroskopiskt samt biokemiskt. Inga förändringar sågs i det andra örat som behandlades med
vehikel (etanol) och användes som en intern kontroll.
TSLP (thymic stromal lymphopoietin), ett cytokin som främst produceras av epitelceller, bedömdes
i försöket ha en viktig funktion i utvecklingen av den AD-liknande hudinflammationen då de
MC903-behandlade öronen innehöll mycket stora mängder TSLP. Hos mössen som saknade MC
var TSLP-nivåerna signifikant lägre, vilket tyder på en central roll för MC i denna modell. Även om
MC903-behandlingen inducerade högre cytokinnivåer (bl.a. TSLP, interleukin 33 (IL-33)), var den
kliniska bilden mildare hos Wsh+/- möss jämfört med Wsh-/- möss (som saknar MC). Detta indikerar
en drivande roll för MC i den AD-liknande hudinflammationen som uppstår efter applikation av
MC903, samtidigt som MC har en begränsande roll för inflammationen. En liten in vitro studie som
utfördes under detta projekt, bevisade att MC903 även kan aktivera MC direkt till degranulering.
Ingen tydlig roll för mMCP-4 i denna musmodell kunde påvisas, då det enbart minskade nivåerna
av IL-33, troligen via klyvning av cytokinet. Klyvningsstudien av TSLP visade en snabbare
nedbrytning av TSLP med tryptas än med kymas. Som en fortsättning på denna studie vore det
därför intressant att närmre undersöka rollen av tryptas i den MC903-inducerade AD-modellen.
Sammanfattningsvis gav en upprepad applikation av MC903 uppkomst till en AD-liknande, lokal
hudinflammation vilket visar att metoden fungerar som en AD-modell. MC bidrar i sjukdomsutvecklingen genom att höja cytokin-nivåerna, men förhindrar samtidigt en överdriven inflammation.