Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

The dog has often served as a model animal for humans in scientific studies. This is due to the fact that dogs are susceptible to a wide range of diseases which also affect humans. One example is cancer, a condition that affects dogs as well as owners. Neoplastic diseases account for 18-23 % of all deaths in dogs (Bonnet et al., 2005 and Jagielski et al., 2002).

Mammary tumor, or tumor of the breast, is the most common tumor form in intact dogs and women (Im et al., 2013). Mammary tumors originate in the udder, and are classified according to their histological characteristics. The dog has five pairs of mammary glands, and tumors are most commonly found in the most cranial and caudal of the glands. Lymphoma, or lymphosarcoma, is defined as a malignant tumor form originating from lymphocytes. It is the most common hematopoietic tumor in dogs. The incidence of lymphoma may be even higher in dogs than in humans (Jagielski et al., 2002).

Thymidine kinase 1 (TK1) is a cytosolic enzyme expressed during the S-phase of the cell cycle. It catalyzes the phosphorylation of deoxythymidine into deoxythymidine monophosphate (dTMP). dTMP is then phosphorylated into deoxythymidine triphosphate (dTTP), which can be used as a substrate in the salvage pathway synthesis of DNA. The availability of dTTP is the rate limiting step in the DNA synthesis. Measurement of the activity of thymidine kinase in serum has been utilized to determine prognosis and result of treatment in animals and humans with hematopoietic malignancies. However, some patients with solid tumors do not express elevated levels of thymidine kinase in serum, and this has been a problem in past studies focused on serum assays.

The aim of this study is to investigate the expression of TK1 in tissue samples of lymphomas and mammary tumors immunohistochemically. Immunohistochemical detection of the proliferation marker TK1 may theoretically aid routine examination of histological samples postsurgically. Analysis of TK1 in tissue samples may be of use to establish minimal residual disease (MRD), and an elevated expression of TK1 may be indicative of a non-successful surgical treatment result.

20 mammary tumors (40% benign lesions) and 17 lymphoma cases were analyzed immunohistochemically at the National Veterinary Institute in Uppsala, Sweden. Out of those 17 lymphoma cases, 9 were of B-cell origin and 8 were of T-cell origin. 4 samples of normal lymph node tissue and 3 samples of normal udder tissue were also analyzed. The tissue samples used in this study had been previously fixed in formalin and were available in paraffinized sections. Tissue sections of 2-3 μm were deparaffinized and labeled with an anti-TK1 antibody (XPA 161, clone 528-2, Arocell). A labelled streptavidin-biotin system was used for detection (LSABTM, Dako) and 3,3´-diaminobenzidine (DAB) was used as chromogen. An appreciation of the percentage of positive cells was made manually by light microscopy and a mitotic index simultaneously counted. The expression of thymidine kinase was plotted against the mitotic index to see if a correlation existed.

The chosen method did not render positive results in mammary tumor cells. This was due to dissatisfactory signal intensity and background staining. Some staining was apparent in capsular lymphocytic infiltrations and in the stroma of two tumors. The median percentage of positive cells in lymphoma samples was 0,8% for B-cell lymphomas and 1,8% for T-cell lymphomas. The median value in normal lymph nodes was 1,3%. The expression of thymidine kinase was not correlated to mitotic index, and could not be statistically validated due to insufficient amount of samples.

In conclusion, there are indications that this method could be of use on tissue samples from patients with lymphoma. If the method is refined, detection of thymidine kinase may be of value to detect minimal residual disease. However, future studies will require trials of new antibodies and perhaps the use of an alkaline phosphatase based system. It would also be advisable to work with live patients, in order to analyze serum samples simultaneously.

Hunden har fått tjäna som modelldjur för människan i många vetenskapliga studier. Detta beror på att hunden drabbas av samma typ av sjukdomar som människan. Ett exempel är cancer, som ofta drabbar såväl hundar som deras ägare. Neoplasier orsakar 18-23 % av dödsfallen hos hundar (Bonnett et al., 2005 och Jagielski et al., 2002).

Juvertumörer, eller tumörer i bröstet, är den vanligaste tumörformen hos intakta tikar och kvinnor (Im et al., 2013). Juvertumörer har sitt ursprung i juvervävnaden och klassificeras enligt histologiska kriterier. Hunden har 10 juverdelar (fem par), och juvertumörer återfinns oftast i de mest kraniala och kaudala delarna. Lymfom, eller lymfosarcom, är en malign tumörform som har sitt ursprung i den lymfocytära cellpopulationen. Det är den vanligaste hematopoetiska tumörformen hos hundar. Incidensen av lymfom uppskattas vara högre hos hundar än hos människor (Jagielski et al., 2002).

Thymidin kinas 1 (TK1) är ett cytosoliskt enzym som uttrycks under cellcykelns S-fas. Det katalyserar fosforyleringen av deoxythymidin till deoxythymidinmonofosfat (dTMP). dTMP fosforyleras sedan vidare till deoxythymidintrifosfat (dTTP), som i sin tur kan användas som substrat i salvage pathway syntesen av DNA. Tillgången på dTTP är det hastighetsbestämmande steget i DNA-syntesen. Mätningar av aktiviteten av TK1 med serum som provmaterial har använts för att bestämma prognos och undersöka behandlingsresultat hos djur och människor med hematopoetiska neoplasier. Många patienter med solida tumörer uppvisar dock ingen förhöjning av enzymaktiviteten i serum, och detta har varit ett problem i tidigare studier där serum har använts som provmaterial.

Syftet med denna studie är att undersöka uttrycket av TK1 immunohistokemiskt i vävnadsprover från hundar med juvertumörer och lymfom. Immunohistokemisk detektion av proliferationsenzymet thymidinkinas kan teoretiskt bli ett framtida hjälpmedel vid rutinmässig histologisk undersökning. Metoden skulle kunna ha en framtida applikation vid vävnadsundersökningar på extirperad vävnad efter kirurgiska ingrepp. Analys av TK1 i vävnadsprov skulle kunna vara av värde för att fastställa minimal residual disease (MRD) efter cytostatikabehandling, och ökat uttryck av TK1 i vävnad kan teoretiskt indikera att ett kirurgiskt ingrepp ej lyckats avlägsna en förändring med marginal.

20 juvertumörer (40 % benigna lesioner) och 17 lymfomfall analyserades immunohistokemiskt på Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA) i Uppsala. Av de 17 lymfomfallen var 9 B-cellslymfom och 8 T-cellslymfom. 4 prov från normala lymfknutor och 3 prover från normal juvervävnad analyserades med samma metod. Vävnadsproven hade tidigare fixerats i formalin och fanns tillgängliga för studien i paraffinklossar. Vävnadssnitt om 2-3 μm avparaffinerades och märktes in med en anti-TK1 antikropp (XPA 161, klon 528-2, Arocell). Ett streptavidin-biotin system användes för detektion (LSABTM, Dako) och 3,3´-diaminobenzidin (DAB) användes som kromogen. En uppskattning av hur många procent av cellerna som var positiva för TK1 gjordes manuellt i ljusmikroskåp. Ett mitotiskt index räknades också manuellt. Uttrycket av TK1 plottades mot mitotiskt index för att se om en korrelation mellan parametrarna förelåg.

Något uttryck av TK1 kunde ej detekteras i juvertumörcellerna med den valda metoden. Detta berodde på otillräcklig signalstyrka i kombination med bakgrundsinfärgning. Dock kunde uttryck av TK1 ses i kapsulära lymfocytinfiltrat och stromat hos två tumörer. Medianuttrycket hos lymfomen var 0,8 % för B-cellslymfom och 1,8 % för T-cellslymfom. I normalvävnaden var medianuttrycket 1,3 %. Uttrycket av TK1 var ej korrelerat till mitotiskt index och kunde ej analyseras med statistisk signifikans på grund av otillräcklig provmängd.
Sammanfattningsvis finns indikationer på att denna metod kan vara användbar på vävnad från patienter med lymfom. Metoden kan ha framtida användning för att fastställa MRD. Dock kommer framtida studier att kräva validering av nya antikroppar och kanske även ett byte till ett alkalinfosfatasbaserat detektionssystem. Det kan också vara av värde att arbeta med levande patienter, så att det blir möjligt att analysera serumprov simultant.