Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

BAKGRUND
Kattens trombocyter har egenskaper som gör att dagens automatiska och manuella hematologianalyser ofta ger falskt låg trombocyträkning (pseudotrombocytopeni).

Trombocyträkningen (PLT) riskerar att bli missvisande låg på grund av att trombocyterna hos katter kan vara mycket större än trombocyterna hos övriga arter, samt för att katters trombocyter in vitro ofta är så lättaktiverade att aggregat bildas. En del av de största trombocyterna räknas inte av de automatiska hematologiinstrumenten (framför allt impedanstyper) och trombocytaggregat medför att trombocyterna blir ojämnt fördelade i blodprovet. Vid sant låga trombocytvärden kan livshotande blödningar uppstå och det är därför viktigt att kunna skilja katter med sann trombocytopeni från katter med falsk trombocytopeni.

Trombocytaggregering har effektivt förhindrats med prostaglandin E1. Prostaglandin E1 är dock mycket instabilt i rumstemperatur, vilket medför att effekten lätt kan utebli vid felhantering. Nyligen presenterade en studie analogen iloprost. Iloprost är temperaturstabilt och lättare att använda. Den relativa volymen trombocyter i blodet (plateletkrit, PCT) var fysiologiskt och kliniskt mer viktig när stora trombocyter (makrotrombocyter) hittades hos hundrasen Cavalier King Charles Spaniel. Katter kan också ha makrotrombocyter, och därför skulle PCT kunna utgöra ett bättre test av trombocytstatus. PCT mäts direkt av hematologiinstrumentet QBC VetAutoread (IDEXX) och indirekt av hematologiinstrumentet Advia 2120 (Siemens).

SYFTE
Syftet med denna studie var att förbättra trombocyträkningen hos katter, både sett till val av antikoagulans i blodprovrör och val av analysmetod. Fyra olika trombocyträkningsmetoder jämfördes för att utvärdera vilken metod som är bäst i olika situationer. Antikoagulans (EDTA utan annan tillsats (EDTA), EDTA med tillsats av prostaglandin E1 (PGE), EDTA med tillsats av iloprost (ILP)) undersökes avseende vilket/vilken kombination som medför lägst förekomst av trombocytaggregat och högst trombocyträkning. Hypotesen var att tillsats av iloprost i EDTA-rör i kombination med PCT eller optisk PLT skulle förbättra möjligheten till bedömning av katters sanna trombocytstatus. Omfattningen av trombocytaggregat på blodutstryk och i manuell räknekammare bedömdes och jämfördes mot minskningar i PLT, med målsättning att avgöra hur många aggregat som kan accepteras för att laboratoriepersonal ska kunna svara ut ett instruments trombocyträkning.

METODER
Blod från 35 katter togs i EDTA-rör. När tillräcklig blodvolym erhölls blandades blodet så fort som möjligt med de trombocytaktiveringshämmande substanserna prostaglandin E1 respektive iloprost. Trombocyterna räknades med manuell räknekammare, Advia 2120 och med QBC VetAutoread.
Plateletkrit presenterades direkt med QBC VetAutoread (redovisat i PLT) och indirekt med Advia. Förekomst av trombocytaggregat, sett till mängd och storlek, kontrollerades med manuell räknekammare och på blodutstryk.

RESULTAT
Tillsats av iloprost förbättrade blodprovskvalitéten bäst. Det påvisades fler blodprover med många och stora trombocytaggregat med EDTA utan annan tillsats, än i blodprover med tillsats av iloprost eller prostaglandin E1. ILP hade lägst förekomst av trombocytaggregat.
Trombocyträkningen påverkades negativt först vid omfattande aggregatbildning (av oss klassificerad som grad 3 och 4). Resultat från optisk flödescytometri visade att 8 av 34 katters blodprov fick tydligt högre trombocyträkning med iloprosttillsats än med EDTA utan annan tillsats. I samtliga dessa 8 fall hade EDTA-blodet hög förekomst av trombocytaggregat (grad 4).

Med iloprosttillsats var korrelationen (r2) i PLT mellan Advia och manuell räknekammare väldigt hög, 0,92 (n = 33). Motsvarande korrelation (r2) med EDTA-blod utan annan tillsats var 0,85. När det förelåg omfattande trombocytaggregering redovisade manuell räknekammare högre PLT än Advia. Korrelationen (r2) mellan Advia PCT ILP och Advia PLT ILP var lägre än förväntat. QBC PLT visade på lägst precision och korrelerade dåligt till både Advia PLT och Advia PCT.

SLUTSATSER
Tillsats av iloprost till EDTA hade större aktiveringshämmande effekt på trombocyter än både EDTA med tillsats av prostaglandin E1 och EDTA utan annan tillsats. Kombinationen EDTA och iloprost bedöms utgöra det bästa sättet för att minska risken för felaktig diagnostisering av trombocytopeni. Tillsats av iloprost är mycket billigare än tillsats av prostaglandin E1, och det är betydligt mer lätthanterligt.

Med vårt graderingssystem för trombocytaggregering kan laboratorierna avgöra när en trombocyträkning kan svaras ut, trots förekomst av trombocytaggregat (grad 1 och 2). Tydligt negativ påverkan på PLT sågs endast i samband med omfattande aggregering. Vid god blodprovskvalitét fungerade Advia PLT bra. Vid tydlig trombocytaggregering är rekommendationen att ta om blodprovet med tillsats av iloprost. Manuell trombocyträkning i räknekammare tycktes påverkas mindre av trombocytaggregat än räkning med automatiska hematologiinstrument.

Låg korrelation mellan Advia PLT och Advia PCT orsakades sannolikt av att MPV kan variera mycket inom denna djurart. Advia PCT bör ge en bättre bild av kattens trombocytstatus och det fysiologiska tillståndet, men fler studier krävs innan man kan fastställa vilken metod som kliniskt är mest betydelsefull. I framtiden kan blodprovrörtillsats med iloprost i kombination med PLT och/eller PCT från optiska instrument (som Advia) komma att utgöra det bästa alternativet för bedömning av trombocytstatus hos katt. QBC VetAutoread fungerade, enligt resultaten i denna studie, och i motsats till nyttan hos Cavalier King Charles Spaniel, inte bra för bedömning av trombocyter hos katt.

BACKGROUND
The platelets of the cat have traits that cause both automatic and manual methods to report falsely low platelet countings (psudothrombocytopenia). The platelet count can be misleadingly low because feline platelets often are much larger than platelets among other species, and because the platelets of the cat are easily activated in vitro to form aggregates. The largest platelets are missed by automatical hematology instruments, especially impedance types, and platelet aggregates means the platelets are not evenly distributed in the sample. When true thrombocytopenia is present, lifethreatening bleedings can develop. Therefore it is important to differ cats with true thrombocytopenia from cats with false thrombocytopenia.

Formation of platelet aggregates have been successfully prevented with prostaglandin E1. However prostaglandin E1 is very instabile in room temperature, and incorrect handling of prostaglandin E1 can neutralize its effect. Recently a study recommended use of the analogue iloprost. Iloprost is temperature stabile, easier to handle and less likely to lose its effect. The relative volume of platelets in blood (plateletcrit in %) was more physiological and clinically important when large platelets (macrothrombocytes) were found in Cavalier King Charles Spaniel dogs. Cats also have macrothrombocytes, therefore plateletcrit may be a better test of platelet status. Plateletcrit is measured directly by the QBC VetAutoread (IDEXX) and indirectly by the Advia 2120 (Siemens).

OBJECTIVES
The goal of this study was to improve platelet counting among cats by comparing types of anticoagulation in blood collection tubes and different analytic methods. Four different methods for platelet counting were compared to see which gave the highest and most consistent results. The anticoagulation types (EDTA without other additive (EDTA), EDTA with additive of prostaglandin E1 (PGE), EDTA with additive of iloprost (ILP)) were evaluated to give the least formation of platelet aggregates and the highest platelet counts. The hypothesis was that an addition with iloprost in EDTA collection tubes, in combination with plateletcrit or optical platelet counting, would contribute to a higher, and more likely true, platelet count. The severity of platelet aggregation on a blood smear or in the manual bürker chamber was classified and compared to reduction in PLT with a goal of determining how many aggregates could be acceptable and permit a laboratory to report the instrument´s PLT.

METHODS
Blood from 35 cats was first collected into tubes containing EDTA. When sufficient blood was available it was divided into three parts and as quickly as possible mixed with iloprost respective prostaglandin E1. The platelets were counted with a manual bürker chamber, Advia 2120 and QBC VetAutoread. The plateletcrit was reported indirectly by the Advia, and directly by the QBC VetAutoread (though reported as PLT). The presence of platelet aggregates, with attention to both number and size, was determined with the bürker chamber and on blood films.

RESULTS
Addition of iloprost improved the blood sample quality best. There were more blood samples with many and large platelet aggregates with EDTA without another additive, than in blood samples with an additive with iloprost or prostaglandin E1. ILP blood had the fewest samples with aggregates. The platelet counting was overtly negatively affected only when there was extensive aggregate formation (grades 3 and 4 of our classification system). The results from the optical flow cytometry showed that 8 of 34 cat blood samples had clearly higher platelet counts with additive with iloprost than with EDTA with no additive. In all 8 cases, the EDTA blood had extensive aggregate formation (grades 4 of our classification system).
Comparing samples with addition of iloprost as the best samples, the correlation (r2) of PLT between Advia and the manual method was very good at 0,92 (n = 33). The correlation (r2) was 0,85 with EDTA without another additive. When there was extensive platelet aggregation, the manual bürker chamber reported higher PLT than Advia. The correlation (r2) between Advia PCT and Advia PLT was lower than expected. QBC PLT showed the greatest imprecision and the correlation to both Advia PLT and Advia PCT was low.

CONCLUSIONS
EDTA with additive of iloprost had a superior effect in inhibiting platelet activation than both EDTA with additive of prostaglandin E1 and EDTA without other additive. An additive of iloprost is considered to be the best alternative to reduce the risk of false diagnoses of thrombocytopenia. Addition of iloprost is much cheaper than prostaglandin E1, and it is much easier to handle.

Our aggregation grading system should be useful for deciding when a laboratory may report a PLT despited mild aggregation (grades 1 and 2). Prominent decreases in PLT was only seen in connection with extensive platelet aggregation. With blood samples of good quality, the Advia PLT worked well. When extensive platelet aggregation occurs our recommendation is to resample the patient using ILP. Manual PLT appeared less affected by severe platelet aggregation than instrument PLT.

Advia PLT and PCT gave different indications of platelet amount in the same samples. This was indicated by low correlation between Advia PLT and Advia PCT. The difference is likely influenced by great varies in MPV within this species. The Advia PCT may better reflect the feline platelet mass and physiologic response, but further work is needed to determine which method may be clinically most important. The optimal feline counting system for the future may be addition of iloprost in blood collection tubes in combination with PLT and/or PCT with optical methods (laser based flow cytometers like Advia). The QBC VetAutoread did, according to the results in this study, and in contrast to the use for Cavalier King Charles Spaniel dogs, not work well for evaluation of platelets among cats.