Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

The aim of this master thesis was to examine a possible connection between chromatin functions and the DNA damage repair system, with the imprinted IGF2/H19 locus as a bait. Interactions can occur within and between chromosomes and it has been shown that H19 ICR on both alleles can communicate with alleles on other chromosomes. The methylation-sensitive insulator protein CTCF is bound on the maternal H19 ICR and acts as an insulator by blocking the IGF2 promoter to access its enhancers. This is possible by formation of loop structures by CTCF that enables intra and inter-chromosomal interactions. CTCF is poly(ADP-ribosyl)ated by PARP-1 when it is bound to H19 ICR. It has been shown that poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 are important in DNA repair, chromatin remodelling and epigenetic regulation of chromatin structures. ATM physically and functionally interacts with poly(ADP-ribosyl)ation and phosphorylation of H2AX to γH2AX that is important events in DNA repair. Chromatin immunoprecipitation and DNA fluorescent in situ hybridization can help answering the question if the components involved in DNA repair are present at H19 ICR when CTCF is bound and poly(ADP-ribosyl)ated. The conclusion obtained from the results is that PAR, PARP-1, ATM and γH2AX are present at the H19 ICR only on the maternal allele. The results reliability is low. There was a big variation between replicates in ChIP and there was no time for a 3D analysis of DNA FISH results.

Syftet med detta projekt är att se om det finns någon möjlig koppling mellan kromosom-interaktioner och systemet för reparation av DNA, med fokus på det föräldrapräglade IGF2/H19 lokuset. Interaktioner kan uppstå inom och mellan kromosomer och forskning har visat att H19 Imprinting Control Region, ICR på båda allelerna kan kommunicera med alleler på andra kromosomer. Det metyleringskänsliga isolatorproteinet CTCF binder till H19 ICR på den maternella allelen och fungerar där som en isolator som förhindrar IGF2 promotorn att samverka med sin enhancer. Detta är möjligt genom att CTCF bildar en loopstruktur som också ger möjlighet till intra och interkromosomala interaktioner. CTCF är poly(ADP-ribosyl)erad av PARP-1 när den är bunden till H19 ICR. Forskning har visat att poly(ADP-ribosyl)ering av PARP-1 är viktigt för reparation av DNA, omformning av kromatin och epigenetisk reglering av kromatinstrukturer. ATM interagerar både fysiskt och funktionellt med poly(ADP-ribosyl)ering men också genom att fosforylera H2AX till γH2AX, vilket är en viktig process i reparation av DNA. Immunoprecipitering av kromatin och DNA fluorescens in situ hybridisering kan hjälpa till att svara på frågan om faktorer involverade i reparation av DNA är representerade på H19 ICR när CTCF är bunden och poly(ADP-ribosyl)erad. Slutsatsen utifrån resultaten är att PAR, PARP-1, ATM och γH2AX är representerade på H19 ICR på den maternella allelen, men resultaten är dock inte så tillförlitliga. Detta p.g.a. stor variation mellan replikat i ChIP och ingen tid till att göra en 3D analys av DNA FISH resultaten.