Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Anthelmintika-resistens (AR) är ett växande problem som ses världen över. Hos hästens spolmask Parascaris spp. har AR konstaterats för flera grupper av anthelmintika. Exakt vad som händer vid AR är inte helt klarlagt men cellulär transport och metabolism verkar förändras. En tidigare studie har framgångsrikt färgat in grisens spolmask Ascaris suum med Resazurin för att utläsa den metabola effekten vid anthelmintikabehandling och med BSA-FITC för att undersöka larvernas ”aptit” vid stress. Målet med denna studie var att etablera två olika fluorescerande in vitro- metoder, med syftet att undersöka metabola förändringar i infektiösa L3 larver samt upptag av utsöndrade parasitära extracellulära vesiklar i värdcellerna. För att kontrollera ömsning av L2 kutikel användes bovint serumalbumin (BSA) infärgat med FITC som L3 larverna kan äta.

Resazurininfärgning av Toxocara canis och Parascaris spp. visade att 100 µM thiabendazol (TBZ) löst i 0,5 % DMSO inducerade en signifikant reduktion i fluorescens-signal jämfört med kontroll, 0,5 % DMSO. Vid rörelseräkning sågs också en minskad aktivitet hos larver behandlade med TBZ. Detta tyder på att Resazurininfärgning av parasitlarver är en möjlig metod för att direkt kunna undersöka effekten av anthelmintika. Tyvärr gav infärgning med BSA-FITC inte lika tydliga resultat som med Resazurin i denna studie, varför fler studier behövs för att utröna hur metoder för anthelmintika-bestämning in vitro bäst ska utformas. Utsöndrade extracellulära vesiklar samlades från L3-larver och infärgades med SYTO® RNASelect™ för att undersöka om en human tarmcellinje, Caco2, kan ta upp dessa. Ett försök utfördes med tecken på lyckad infärgning av extracellulära vesiklar, där exponerade Caco2-celler vid fluorescensmikroskopering uppvisade multipla fluorescerande cytosola nodulära områden. Upprepade försök behövs dock för att klargöra om infärgning av vesiklarna var lyckad och för att förbättra metoden.

The recent increase in anthelmintic resistance (AR) among roundworms is of global concern. One study showed successful Resazurin and BSA-FITC staining of Ascaris suum L3 larvae in an anthelmintic metabolic activity trial. However, to our knowledge no previous studies have tested if Toxocara canis and Parascaris spp. L3 larvae stains with these molecules. Therefore, our first aim was to investigate whether Resazurin and BSA-FITC could be used for staining of these two nematode species. Our results show positive Resazurin staining in both species, with fluorescent nodules at multiple locations inside the larvae. Furthermore L3 larvae treated with 100µM of the anthelmintic drug thiabendazole (TBZ) showed a significant reduction in fluorescence intensity as well as reduced trashings, compared to controls (0,5% DMSO), suggesting that the impact of the ”stressor” is readable with the Resazurin method. The results of BSA-FITC staining were not as clear as Resazurin staining in this study, why more research is needed to fully understand the potential of this method for anthelmintic trials.

The second aim of this study was to stain extracellular vesicles excreted from L3 larvae from the two species with SYTO® RNASelect™ green fluorescent stain, to explore if vesicles could enter the human intestinal Caco2 cell line. Interestingly, multiple fluorescent structures were found in the Caco2 cells when exposed to SYTO-stained extracellular vesicles. However, only one staining of vesicles was performed, why more trials have to be done before a firm conclusion can be made.

Keywords: anthelmintic resistance, nematodes, Toxocara canis, Parascaris univalens, Parascaris spp., Resazurin, fluorescence, extracellular vesicles, staining