Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Råmjölken innehåller livsviktiga antikroppar som ger kalven dess immunförsvar under de första månaderna i livet. För att kontrollera att kalven fått i sig en tillräcklig mängd antikroppar tas ett blodprov och detta serum analyseras med avseende på antikroppar. Det finns olika metoder för att mäta mängden antikroppar, direkta och indirekta. Två exempel på indirekta metoder är optisk refrakto-meter och Brix-refraktometer. Dessa metoder mäter brytningsindex i serum vilket korrelerar med torrsubstansen och därmed totalproteinet, vilket är en markör för antikroppsupptag. Inom detta arbete undersöktes om det är möjligt att utföra dessa analyser på serum från ocentrifugerade blodprover. Eftersom hemolys, att de röda blodkropparna går sönder, är vanligt vid provtagning och ofta stör olika analysmetoder så undersöktes även om hemolys kan störa resultatet.
Syftet var även att få praktisk erfarenhet av hantering av ocentrifugerade blodprover. Analys av ocentrifugerat blodprov skulle kunna möjliggöra analys av antikroppar direkt på gården av lantbrukaren själv.
Kalven klassas som att ha ett bristfälligt upptag av antikroppar, på engelska failure of passive transfer (FPT), om den har ett immunoglobulin G-värde (IgG-värde) i serum under 10 g/l. Mätt med indirekta metoder har gränsvärdena i Sverige bestämts till 55 g/l med optisk refraktometer och 8,4 Brix%.
I detta arbete har serumprover från 50 kalvar, 2–8 dagar gamla samlats in på försöksgården Lövsta. Från varje kalv samlades tre provrör in. Ena röret centrifugerades och användes som basvärde, andra röret centrifugerades inte utan tilläts självsedimentera och i det tredje röret framkallades hemolys.De första tio ocentrifugerade blodproverna förvarades i kylskåp men då detta inte fungerade, på grund av att koaglet lade sig som en plugg överst i provröret, så ändrades strategin till att de fick stå framme i rumstemperatur i 48 timmar. Hemolys framkallades genom skakning samt att rören fick stå i nio dagar och blodprovet centrifugerades innan analysering. Alla prover analyserades med en optisk refraktometer och en Brix-refraktometer. Ocentrifugerat prov jämfört med centrifugerat prov uppmätt med optisk refraktometer gav en Pearsons korrelationskoefficient på 0,98. Differensen mellan metoderna fick ett medelvärde på 1,2 g/l. Vid utvärdering av differenserna kring gränsvärdet 55 g/l var medelvärdet 2 g/l. Parat t-test visade på en skillnad mellan metoderna och därför rekommenderas en höjning av gränsvärdet till 57 g/l vid analysering av ocentrifugerat blodprov med en optisk refraktometer.
Ocentrifugerat prov jämfört med centrifugerat prov uppmätt med Brix-refraktometer gav en Pearsons korrelationskoefficient på 0,99. Differensen mellan metoderna fick ett medelvärde på 0,02 Brix%. Parat t-test visade att det inte finns en signifikant skillnad mellan metoderna. Detta betyder att gränsvärdet för Brix-refraktometern inte bör ändras och att metoden förmodligen kan användas men en djupare undersökning av denna metod är önskvärd. Framför allt bör kalvar med ett lågt upptag av antikroppar undersökas för att titta närmare på hur det ser ut kring gränsvärdet. Detta hade även varit önskvärt för den optiska refraktometern.
Resultaten visar också att måttligt och kraftigt hemolyserade blodprov inte bör analyseras då det ger osäkra resultat. Blodprov med lindrig hemolys kan antagligen användas men på grund av för lite statistiskt underlag i frågan så är mer undersökning önskvärt. Av de 50 kalvar som provtogs på Lövsta klassades ca 16 % som FPT.

Calves are born without a functional immune system and are dependent on the antibodies in the colostrum provided by the cow to get protection from pathogens. To verify the uptake, it is possible to take a blood sample from the calf and analyse it for antibodies. There are different methods to measure antibodies, both direct and indirect. Two indirect methods are using the optical refractometer and the Brix-refractometer. These methods of analysis measure the refractive index in the serum which correlates with the dry matter content and can be correlated to the total protein concentration in the serum. In this essay the possibility to analyse non-centrifuged blood samples with refractometry is evaluated as well as to what extent haemolysis affects the results. The purpose was also to get practical experience of handling non-centrifuged blood samples. The possibility to analyse non-centrifuged blood samples would enable on-farm analysis.
To get an overview of the calf management in a herd it is recommended in Sweden today that a veterinarian collects blood samples from 3-4 calves, centrifuges and analyses them. The calf is classified as having an inadequate uptake of antibodies, also called failure of passive transfer, if the levels of serum IgG, which is the dominating antibody in colostrum, are below 10 g/L. With indirect methods, limit values in Sweden have been set to 55 g/L with the optical refractometer and 8.4 Brix% with the Brix-refractometer.
Serum samples were collected from 50 calves, 2-8 days old, at Lövsta farm. Tree blood samples were collected from each calf. The first sample was centrifuged and used as the base value, the second blood sample was not centrifuged but let to self-settle and in the third one haemolysis was generated. The first ten non-centrifuged blood samples were refrigerated with no success, the blood clot ended up at the top of the sample and made it difficult to access clean serum. The strategy was changed so the blood samples were left in room temperature for 48 hours instead. Haemolysis was generated by shaking of the samples and letting them sit for 9 days at room temperature. All the samples were analysed by both optical refractometer and Brix-refractometer.
Non-centrifuged vs centrifuged blood samples using optical refractometer gave a Pearson´s correlation coefficient of 0.98. The difference between the methods had an average value of 1.2 g/L. When only the values around the limit value, 55 g/L were evaluated, the average value was 2 g/L. The paired t-test showed a difference between the methods and therefore adjusting the limit from 55 g/L to 57 g/L is recommended.
Non-centrifuged vs centrifuged blood samples using the Brix-refractometer gave a Pearson’s correlation coefficient of 0.99. The difference between the methods had an average value of 0.02 Brix%. The paired t-test showed that there was no difference between the methods. This means that the limit should not be adjusted, and that the method could probably be used. However, more research would be preferable.
The results show that moderately and severely haemolyzed samples should not be used as they provide uncertain results. Mildly haemolyzed samples can possibly be used. Out of the 50 calves tested at Lövsta, 16% suffered from FPT.