Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Syftet med denna studie var att undersöka möjliga ärftliga faktorer till nedsatt spermiekvalitet hos
berner sennenhundar i Sverige. I tidigare morfologiska studier av sperma från berner sennenhundar
konstaterades att de har ett förhöjt antal svansdefekter jämfört med normalvariation för hundar.
Utifrån detta valde vi att undersöka gener involverade i bildningen av spermiens flagell i en
kandidatgenapproach. Eftersom det finns få studier inom detta område hos hund valde vi ut
kandidatgener som visats orsaka svansdefekter hos möss och människor, dessa var Dynein Heavy
Chain 1 (DNAH1) och Armadillo Repeat Containing 2 (ARMC2). Vi begränsade undersökningen
till att undersöka exon 73 i DNAH1 och exon 4, 8, 10, 16 & 17 i ARMC2 med PCR och Sangersekvensering från åtta hanhundar av rasen berner sennen. För PCR-sekvensering använde vi
genomisk DNA från helblod. Från 91 av totalt 96 PCR-sekvenseringar var resultaten av god kvalitet
och kunde analyseras. Från tre individer erhölls specifika PCR-produkter från antingen forward eller
reverseprimern, och från en individ erhölls ingen produkt från exon 16 från ARMC2 genen. Inga
mutationer som setts i dessa gener hos möss och människor med astenozoospermi kunde ses hos
dessa hundar.
För att undersöka om det är möjligt att relatera mängden mRNA från utvalda gener till spermiekvalitet från fryst och färsk sperma analyserades färsk och fryst sperma från en beagle samt fryst
sperma från en berner sennenhane. RNA extraherades med och utan tillsats av Ribonukleas (RNas)
inhibitor och RNA Integrity Number (RIN) värdet med och utan denna tillsats jämfördes. Kvaliteten
på RNA isolatet utvärderades med hjälp av en Agilent Tapestation, som bestämmer ett RIN-värde
på en skala mellan 1 och 10. I studien erhölls det högsta RIN värdet på 5,8 när färsk sperma
analyserades med tillsats av RNas inhibitor. Det lägsta RIN värdet var 2,7 vilket erhölls när fryst
sperma analyserades från en berner sennen men som fick RNas inhibitor tillsatt vid analys, och från
färsk sperma utan tillsats av RNas inhibitor. Detta var endast en pilotstudie på totalt 3 prover för att
utvärdera metodens effektivitet att utvinna RNA från spermier. Vi kontrollerade också kvaliteten på
färsk vs fryst sperma för att få information om metodens effektivitet.
Ytterligare studier behövs för att finna den genetiska bakgrunden till nedsatt spermiekvalitet hos
berner sennenhundar. Slutsatsen från vår studies andra del är att det sannolikt går att optimera RIN
värdet från hundspermier genom att modifiera protokollet och att det går att använda RNA från
hundsperma för att studera och vidare analysera genuttryck från intressanta gener.
Nyckelord: Berner sennen, fertilitet, spermiekvalitet, spermiemorfologi, kandidatgener, DNAH1,
ARCM2, RNA

The purpose of this study was to investigate possible hereditary factors for impaired sperm quality
in Bernese Mountain Dogs in Sweden. In previous morphological studies of semen from Bernese
Mountain Dogs, it was found that they have an increased number of tail defects compared to the
normal variation for dogs. Based on this, we chose to examine genes involved in the formation of
the sperm flagella using a candidate gene approach. Because there are few studies within this area
in dogs, we selected candidate genes that have been shown to cause tail defects in mice and humans,
these were Dynein Heavy Chain 1 (DNAH1) and Armadillo Repeat Containing 2 (ARMC2). We
limited the study to examining exon 73 in DNAH1 and exons 4, 8, 10, 16 & 17 in ARMC2 using
PCR and Sanger sequencing from eight male Bernese Mountain dogs. For PCR sequencing, we used
whole blood genomic DNA. From 91 of a total of 96 PCR sequences, the results were of good
quality and could be analyzed. From three individuals specific PCR products were obtained from
either forward or reverse primer, and from one individual no product was obtained from exon 16 of
the ARMC2 gene. None of the exons that have been described to harbour mutations in these genes
in mice and humans with asthenozoospermia were shown to have mutations in these dogs.
To investigate whether it is possible to relate the amount of mRNA expressed from selected genes
to sperm quality from frozen and fresh semen, fresh and frozen semen from a beagle and frozen
semen from a male Bernese Mountain Dog were analyzed. RNA was extracted with and without the
addition of RNase inhibitor and the RNA Integrity Number (RIN) values obtained with or without
this addition were compared. The quality of the RNA isolate was evaluated using an Agilent
Tapestation, which determines a RIN value on a scale between 1 and 10. In the study, the highest
RIN value of 5.8 was obtained when analyzing fresh semen with the addition of RNase inhibitor.
The lowest RIN value was 2.7, which was obtained when analyzing frozen semen from a Bernese
Mountain Dog but which had RNase inhibitor added during the RNA preparation, and from fresh
semen without added RNase inhibitor. This was only a pilot study of a total of 3 samples to evaluate
the method's effectiveness in extracting RNA from sperm. We also checked the quality of fresh vs
frozen semen to get an idea of the effectiveness of the method.
Further research is needed to find the genetic background to decreased sperm quality in Bernese
Mountain Dogs. The conclusion from our second part of the study is that it should be possible to
optimize the RNA preparation protocol to obtain better quality of RNA with increased RIN value
from dog sperm and to use RNA prepared from dog sperm to evaluate gene expression of interesting
genes.
Keywords: Bernese Mountain Dog, fertility, sperm quality, sperm morphology, candidate genes,
DNAH1, ARCM2, RNA