Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

In Sweden and in many other countries, artificial insemination (AI) is frequently used in horse
breeding. The technology makes it possible to use genetic material from horses in different
geographical locations in an effective way, minimizing the risk of infection or even injury to both
horses and stud personnel. Semen collection is performed with a high hygienic standard but despite
this, it is seldom possible to obtain an ejaculate that does not contain bacteria. Bacteria in the
ejaculate can cause disease in the mare, or result in a deterioration in sperm quality, thereby reducing
the chance of the mare becoming pregnant after insemination. To ensure disease control and
maintain sperm quality, addition of antibiotics to the semen is therefore required to reduce the
number of bacteria in the ejaculate. To protect the spermatozoa during storage, a semen extender
containing both buffering and nutrient-rich components, but also antimicrobial substances (AMS)
is added. During insemination, the semen dose is deposited in the mare's uterus, which initiates a
response from the local immune system. This results in an immunological and mechanical cleansing
of the deposited material through the cervix uteri, which is an important function for maintaining a
healthy uterine environment and enabling a pregnancy. The mare's vaginal bacterial flora is therefore
exposed to the antibiotics contained in the extender, which could theoretically increase the risk of
developing antibiotic resistance in the bacterial flora.

In this study, vaginal swabs were obtained from 39 mares of varying breeds and ages in northern
Sweden, with the aim of investigating the normal vaginal bacterial flora and how its resistance
pattern is affected by the exposure to the antibiotics (penicillin and gentamicin) contained in the
semen extender INRA-96, and if resistant bacteria are present in the normal vaginal flora of mares.
The mares were categorized into either an exposed group consisting of breeding mares at a stud
farm, or a control group consisting of mares that had never been inseminated. Swabs were taken
from a predetermined area in the cranial vagina just before the first insemination of the season (D0),
with a follow-up sample after three days (D3). The control group was sampled only once, as far as
possible in connection with estrus. The samples were sent by post to the Department of Biomedical
Science and Veterinary Public Health, SLU, Uppsala for analyses. Isolated bacteria were identified
by Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF
MS). Bacterial species that could be isolated from both D0 and D3 in the same mare were analysed
regarding antimicrobial resistance. A comparison was also made between the bacteria and resistance
pattern of bacteria from mares that had never been inseminated. A total of 971 bacterial isolates
were isolated from the 39 mares, with E. coli being by far the most common isolated bacterium
(48.6%). The bacteria included in the antimicrobial susceptibility testing were Staphylococcus
simulans, Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, Streptococcus dysgalactiae and Enterococcus
faecalis. Resistant isolates were identified in all species except Enterococcus faecalis. These isolates
showed resistance to penicillin, oxacillin, fusidic acid, trimethoprim, erythromycin, clindamycin,
nitrofurantoin and tetracycline, depending on species.

Exposure to antibiotics did not affect the resistance pattern in the vaginal bacterial flora in this
study, but there was a difference in the bacterial species obtained before and after insemination
and between the exposed group and the control group. Resistant bacteria were found in the vaginal
flora of both groups.

I Sverige och i många andra länder är det vanligt att använda sig av artificiell insemination (AI) inom hästaveln. Tekniken gör det möjligt att på ett smittskyddssäkert och effektivt sätt använda sig av genetiskt material från hästar som befinner sig på olika geografiska platser, med minskad risk för skador på såväl hästar som stuteripersonal. Spermasamling utförs med hög hygienisk standard, men trots de höga kraven på strikt hygien går det sällan att framställa ett ejakulat som inte innehåller bakterier. Bakterier riskerar att orsaka infektioner och försämra spermakvalitén, vilket minskar chansen för stoet att bli dräktigt. För att säkerställa smittskyddet och bibehålla spermakvalitén krävs därför en efterföljande beredning av sperman för att reducera mängden bakterier i ejakulatet. För att skydda spermierna under tiden spermadoser lagras och transporteras tillsätts därför en spädningsvätska innehållande dels buffrande och näringsrika komponenter, men även antimikrobiella substanser (AMS). Vid inseminationen av stoet initieras en respons från det lokala immunförsvaret, vilket resulterar i en immunologisk och mekanisk rensning av det deponerade materialet ut genom cervix uteri. Detta är en viktig funktion för att upprätthålla en hälsosam livmodermiljö och därav möjliggöra en dräktighet. Stoets vaginala bakterieflora exponeras i och med livmoderns mekaniska rensning för de i spädningsvätskan ingående antibiotikumen, vilket teoretiskt kan öka risken för utveckling av antibiotikaresistens hos bakterierna.

I denna studie provtogs 39 ston av varierande raser och åldrar i norra Sverige, med syftet att undersöka den normala vaginala bakteriefloran hos ston och hur dess resistensmönster påverkas av exponeringen för de i spädningsvätskan INRA-96 ingående antibiotikumen (penicillin och gentamicin) samt undersöka om resistenta bakterier förekommer i den normala vaginala bakteriefloran. Stona kategoriserades i antingen en exponerad grupp bestående av avelsston på stuteri, samt en kontrollgrupp bestående av ston som aldrig inseminerats. Den exponerade gruppen provtogs från ett förutbestämt område i kraniala vagina just innan den för säsongen första inseminationen (D0) samt med ett uppföljande prov efter tre dagar (D3). Kontrollgruppen provtogs enbart en gång, i högsta möjliga mån i samband med att stoet brunstade. Proverna skickades via post och analyserades på Institutionen för biomedicin och veterinär folkhälsovetenskaps laboratorium vid Sveriges lantbruksuniversitet (SLU) i Uppsala. Påvisade bakterier identifierades via Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Bakteriearter som kunde isoleras från både D0 och D3 hos samma sto resistenstestades. Resistensmönstret för dessa bakteriearter jämfördes sedan mellan D0 och D3 samt mot kontrollgruppens resistensresultat av samma bakterieart. Totalt påvisades 971 bakterieisolat från de 39 stona, av vilken E. coli var den överlägset vanligast isolerade bakterien (48.6%). De bakterier som valdes ut för resistensundersökning var Staphylococcus simulans, Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, Streptococcus dysgalactiae och Enterococcus faecalis. Resistenta isolat konstaterades hos alla inkluderade bakteriearter utom Enterococcus faecalis mot (beroende på bakterieart) penicillin, oxacillin, fusidinsyra, trimetoprim, erythromycin, clindamycin, nitrofurantoin och tetracyklin.

I denna studie påverkade inte exponering av antibiotika i spädningsvätskan resistensmönstret hos den vaginala bakteriefloran. Däremot påverkades vilka bakteriearter som isolerades innan och efter insemination samt mellan den exponerade gruppen och kontrollgruppen. Resistenta bakterier förekom i den vaginala bakteriefloran hos de båda grupperna.