Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Strongylus vulgaris (stor blodmask) är den mest patogena parasiten hos häst i Sverige, redan vid låg infektionsdos orsakar parasiten stor skada på blodkärlen som försörjer tarmen. Skadorna kan ge upphov till allvarliga fall av kolik och tromboser. Prevalensen av S. vulgaris har stigit från 3 % i slutet av 90-talet till cirka 26 % vid senaste mätningen 2016. En bidragande faktor till den här utvecklingen är att Sverige för drygt tio år sedan införde så kallad selektiv avmaskning på grund av en ökande resistensutveckling mot anthelmintika hos Cyathostominae (liten blodmask). Ett långsiktigt mål i ett doktorandprojekt vid Immunologiska enheten vid Institutionen för biomedicin och veterinär folkhälsovetenskap är därför att utveckla ett vaccin mot S. vulgaris som alternativ till anthelmintika. I projektet studeras ett nytt adjuvans, G3, och dess effekt på cytokinproduktionen hos equina mononukleära blodceller (eqMBC).

I detta examensarbete har G3 utvärderats vidare. EqMBC har odlats i närvaro av G3, liksom i närvaro av G3 tillsammans med ”Toll like receptor” (TLR) agonisterna Pam3SCK4 (Pam) och FliC. Cytokininduktionen analyserades med qPCR (IL-10, IL-8 och IFN-γ) och ELISA (IFNα). En metod att rena och stråla L3-larver i syfte att studera larvernas effekt på cytokininduktionen i kulturer av eqMBC har utvecklats. En första cellinduktion i eqMBC med dessa preparerade larver, tillsammans med G3 utföres och cytokininduktion (IFN-γ, IFN-α, TGF-β, IL-10, IL-12 och IL-4) analyserades med qPCR.

G3 inducerade generna för IFN-γ och IL-12 samt kunde inhibera uttrycket av generna för IL10 och IL-4. När G3 tillsattes i kulturer av eqMBC tillsammans med andra inducerare, var G3’s effekt på cytokinproduktionen dominant. Vid ett första cellinduktionsförsök med G3 och L3larver observerades att L3 larverna inducerar uttryck av genen för IL-4. Närvaro av G3 hindrade det L3-inducerade uttrycket av IL-4 i eqMBC som istället uttryckte IFN-γ och IL-12.

Olikt många adjuvans på marknaden tycks G3 starkt driva immunreaktionen mot TH1. Detta gör G3 till ett mycket intressant adjuvans i framtida hästvaccin. Möjligheten att använda G3 tillsammans med L3 antigen i ett vaccin mot blodmask behöver studeras vidare. Metoden som utvecklats i detta examensarbete att rena fram och stråla L3 larver, anses fungera bra och kommer tillämpas i de fortsatta studierna med eqMBC.

Strongylus vulgaris is considered to be the most pathogen parasite in Swedish horses. The parasite causes severe damage to the vessels supplying the small and large intestine. This results in arteritis, thrombosis and may cause severe colic. In Sweden, the prevalence of S. vulgaris was about 3% in late 1990s but has according to a new study performed at SLU in 2016 increased to 26%. Most likely, this increased prevalence is due to a selective deworming strategy imposed ten years ago because of signs of anthelmintic resistance in small strongyle (Cyathostominae spp). In a PhD project at the Department of Biomedical Sciences and Veterinary Public Health, SLU, the long-term goal is to develop a vaccine against S. vulgaris using a new adjuvant designated G3. Effects of the adjuvant are so far analysed in cultures of equine mononuclear blood cells (eqMBC).

In the present master project, the cytokine inducing capacity of G3 was further evaluated and a method for isolation, purification and inactivation of L3 larvae stage of S. vulgaris was developed. EqMBC were cultured in the presence of G3 and/or the TLR agonists FliC and Pam3SCK4 (Pam) and the induced cytokine profiles were determined using qPCR (IL-4, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-γ, IFN-α, TGF-β) and ELISA (IFN-γ). After being purified and UVirradiated, the L3 larvae were also included in the cytokine analyses.

The adjuvant G3 alone promoted a TH1 type of response inducing IL-12 and IFN-γ that also seemed to dominate when G3 was combined with other inducers. For instance, the expression of mRNA for IL-10 was inhibited when FliC or Pam were combined with G3. When tested in cultures of eqMBC, the inactivated L3 larvae preparation induced IL-4, indicative of a TH2 type of immune response. Dual exposure of eqMBC to both L3 larvae and G3 abrogated the IL-4 induction and only expression of mRNA for IL-12 and IFN-γ was detected. Thus, G3 seem to be a TH1 promoting adjuvant in the horse with the potential to redirect a TH2 response towards TH1. This makes G3 very interesting as an adjuvant in future equine vaccines. To evaluate G3 as a potential adjuvant in a vaccine against S. vulgaris further studies are required, applying the methods for purification and irradiation of larvae outlined in this project.