Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Sepsis är ett komplext och livshotande tillstånd orsakat av en infektion som skapar en dysreglerad inflammation, vilket ger upphov till ett så kallat Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS). Mortaliteten vid sepsis är hög hos hund och en tidig diagnos och insättande av behandling är därför mycket viktigt överlevnaden. Pyometra är en vanlig sjukdom hos tikar och i en studie av tikar med pyometra klassificerades över hälften som SIRS-positiva, enligt de kriterier som idag används för diagnostik av sepsis hos hund. Patogenesen till sepsis är ännu inte helt klarlagd och definitionen och kriterierna har därför ändrats under årens lopp. Senast år 2016 kom nya riktlinjer inom humanmedicinen som ändrade synen på syndromet till att ses som ett obalanserat hyper- och hypoinflammatoriskt tillstånd och även omfatta organsvikt. SIRS-kriterierna som tidigare varit rådande byttes till det så kallade Sepsis-related Organ Failure Assessment (SOFA), där fler organspecifika parametrar mäts. Detta system har dock ännu inte utvärderats i större omfattning hos hundar med sepsis.
Biomarkörer som har studerats för identifiering av individer med hög sannolikhet för sepsis är bland annat akutfasproteinet C-reaktivt protein (CRP) och ett antal inflammatoriska cytokiner. Ingen av dessa har dock ännu setts på ett säkert sätt kunna identifiera hundar med sepsis. Studier har istället visat att en antikropp mot kemokinen keratinocyte chemoattractant (KC) hos mus kan känna igen förhöjda koncentrationer av ett protein (kallat KC-like) i blodet hos tikar med sepsis. Vid en gensekvensanalys hittades ingen motsvarande gen hos hund för KC, men ett antal C-X-C motif ligand (CXCL)-kemokiner sågs ha hög likhet.
Studien syftade till att analysera vilken av dessa CXCL-kemokiner som KC-antikroppen binder starkast till samt om förhöjda koncentrationer av protein som KC-antikroppen binder till förekommer hos tikar med pyometra och SIRS jämfört med de utan SIRS. De utvalda CXCL-kemokinerna uttrycktes därför i Escherichia coli och analyserades med Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) och western blot. Blodprover insamlade från tikar med pyometra med eller utan SIRS analyserades också med en Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) med KC-antikropp hos mus.
Resultatet från analyserna visar att KC-antikroppen binder framförallt en av de utvalda CXCL-kemokinerna och denna skulle därför kunna vara en potentiell biomarkör för sepsis hos hund. För att bekräfta detta fynd krävs dock ett förbättrat analysprotokoll. Signifikant skillnad i koncentration KC-like sågs mellan grupperna i studien där tikar med pyometra och SIRS sågs ha förhöjda nivåer. Emellertid krävs större och mer detaljerade studier på KC-like för att verifiera dessa resultat. De obalanserade immunologiska processer som sker vid sepsis gör att det i dagsläget är svårt att hitta en tillräckligt säker enskild biomarkör för sepsis. Utveckling av de nuvarande SIRS-kriterierna samt en panel av pro- och antiinflammatoriska biomarkörer, där KC-like skulle kunna ingå, skulle därför kunna vara det effektivaste sättet att identifiera detta allvarliga och komplexa syndrom hos hund.

Sepsis is a complex and life-threatening condition caused by an infection creating a dysregulated inflammation, leading to a Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS). Sepsis-related mortality is high for dogs and an early diagnosis and start of treatment is very important for survival. Pyometra is a common disease in bitches and in a Swedish study of bitches with pyometra over half were classified as SIRS-positive, according to the criterias of that today is used for diagnostics of sepsis for dogs. The pathogenesis of sepsis is not yet clear and the definition and the criterias has changed during the years. The latest guidelines in the human medicine came in 2016 and it changed the view of the syndrome to be seen as an unbalanced hyper- and hypoinflammatory condition and to also include organ failure. The SIRS-criteria which was used earlier were changed to the so called Sepsis-related Organ Failure Assessment (SOFA), where multiple organ-specific parameters are measured. This system has not yet been fully evaluated in dogs with sepsis.
Biomarkers that have been studied to identify individuals with a high likelihood of sepsis is among others the acute-phase protein C-reactive protein (CRP) and a number of inflammatory cytokines. None of these have yet, in a safe way, been able to identify dogs with sepsis. Instead studies have shown that an antibody, directed against the chemokine keratinocyte chemoattractant (KC) in mice, can recognize elevated concentrations of a protein (called KC-like) in the blood of bitches with sepsis. A gene-sequence analysis found no corresponding gene in dogs for KC but a number of C-X-C motif ligand (CXCL)-chemokines was seen to have a high resemblance.
This study aimed to analyse which of these CXCL-chemokines the KC-antibody binds the strongest to and if elevated concentrations of protein that the KC-antibody binds to occur in bitches with pyometra and SIRS compared to bitches without SIRS. The selected CXCL-chemokines was therefore expressed in Escherichia coli and were analysed with Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot. Blood samples collected from bitches with pyometra with or without SIRS was analysed with an Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) with an antibody against KC in mouse.
Results from the analyses show that the KC-antibody especially bind one of the studied CXCL-chemokines, which therefore could be a potential biomarker for sepsis in dogs. To confirm this an improved protocol for analysis is needed. A significant difference in concentration of KC-like was seen between groups in the study where bitches with pyometra and SIRS had higher levels. Detailed studies including more dogs are needed on KC-like to verify these findings. The unbalanced immunologic processes that occur in sepsis make it hard to find a safe individual biomarker for sepsis today. Development of the current SIRS-criteria and a panel of pro- and anti-inflammatory biomarkers, where KC-like could be included, could therefore be the most efficient way to identify this severe and complex syndrome in dogs.