Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

The aim of this Master's Thesis was to investigate the presence and regulation of RNAi in the model organism Dictyostelium discoideum. The background for the project is a cDNA library representing 18-25nt RNAs (9000 clones) from Dictyostelium discoideum that recently was constructed. The result revealed a number of small RNAs with antisense complementary to mRNAs and from these we chose three genes for further investigation; hatA, rsmF, and DDB0230011 (kielin). We also studied two "relatives" to hatA, namely hatB and hatC to see if the genes are similar to each other in the setup of both an mRNA and asRNA. The first aim was to find both mRNA and asRNA for the genes which was done with RT-PCR. We found that all genes have both an mRNA and an asRNA, except for hatC which lacks an asRNA. By performing a Northern blot analysis of hatA mRNA and asRNA during development and in some RNAi knockout strains we found that both RNAs are is down regulated during development and also in some of the knockout strains.

hatA has previously been reported to have a role in osmotic stress. We decided to investigate this effect in two normal Dictyostelium (Ax4:4 and Ax2) strains and two knockout strains, rrpC- and drnA- (done in Ax4:4 and Ax2 respectively). The results revealed that the asRNA and mRNA is down regulated due to stress and that it also differs in gene expression between untreated cells and cells treated with a starvation buffer. The theory based on our results is that the RNA expression goes down during development which is initiated by the starvation buffer and when the hyper osmotic buffer is added the expression goes down even more.

The mRNA predicted to encode a Kielin homolog has previously been proven to be located in the tip of structure that has been allowed to develop for 16 hours and therefore we wanted to study the location of both mRNA and asRNA in this type of structure, also known as a slug. By using Fluorescent In situ hybridization we were able to detect both mRNA and asRNA, where the mRNA seems to be located in the entire structure while the majority of the asRNA can be found in the outer cell layer in one end of the slug.

RNA interference (RNAi) är ett ämne som under hösten 2006 kom upp på tapeten tack vare att Nobelpriset i Medicin och fysiologi tillägnades forskarna Craig Mello och Andrew Fire i just detta ämne. Principen innebär att när dubbelsträngat RNA kommer in i en cell känns det igen av ett protein som kallas för Dicer som klipper ner RNAt i mindre bitar varpå en bit fäster till ett protein komplex (RISC). RISC komplexet snurrar upp den dubbelsträngade RNA biten och delar den i två delar och använder därefter den ena delen som en mall för att hitta bitar som matchar. När komplexet hittar matchande sekvenser på andra RNA molekyler klyvs dessa och därigenom tystas den gen som skulle ha bidragit till ett protein, till exempel ett virus protein.
I mitt examensarbete har jag studerat RNAi hos modellorganismen Dictyostelium discoideum, en amöba som lever i det översta jordlagret och som har en intressant livscykel. Dictyostelium celler lever som encelliga organismer och äter jästsvampar och bakterier, men när svält inträffar skickas en signal substans ut (cykliskt AMP, cAMP) vilket gör att de encelliga organismerna samlar ihop sig och går ihop till en multicellulär organism. Denna organism genomgår därefter ett flertal olika livsstadier innan den slutligen når en struktur där en sporboll sitter högst upp på en lång stjälk, ett utseende som påminner om blomman och frökapseln hos björnmossa.
Bakgrunden till experimenten är ett cDNA bibliotek över små RNA (siRNA) som nyligen konstruerades och där man lyckades hitta några asRNAn (asRNA) som är komplementära till messenger RNA (mRNA). Utifrån dessa valdes tre ut och genom att använda RT-PCR lyckades vi påvisa både asRNA och mRNA från generna. Vi analyserade därefter RNA från celler som utvecklats under olika lång tid för att se om genuttrycket för genen hatA förändras under utvecklingen. Vi studerade även RNA från RNAi knockout stammar för att se om det finns någon skillnad i genuttryck mellan dessa. Genom att använda analysmetoden Northern blot lyckades vi se att genen hatA nedregleras under utvecklingen samt att den är reglerad i vissa av knockout stammarna. hatA kodar för proteinet hisactofilin, ett protein som är viktigt för cellmembranet, och man har i tidigare studier sett att hatA spelar en roll vid hyperosmotisk stress. Celler utsattes först för en svältbuffert och därefter för en buffert innehållandes en hög sockerhalt. När vi sedan analyserade RNA från celler behandlade med enbart svältbuffert och celler behandlade med osmosbufferten och jämförde dessa mot RNA från helt obehandlade celler såg vi att det var skillnad i mRNA och asRNA uttrycket av hatA mellan dels de olika RNA proverna men även mellan de olika cellstammarna som vi använde oss av. Svältbufferten fick cellerna att börja utvecklas och därför gick uttrycket av mRNA och asRNA ner redan där, och när vi därefter tillsatte osmosbufferten gick uttrycket ner ännu mer i vissa av stammarna.
Min hypotes som jag grundar på mina resultat är att hatA nedregleras i och med det att cellerna utvecklas på grund av att hisactofilinet helt enkelt inte behövs i
den multicellulära organismen. Den encelliga organismen behöver hisactofilin i sitt membran för att kunna skydda sig mot miljön runt om kring sig, men i den multicellulära organismen blir det yttre membranet tillräckligt tjockt att nivån av hisactofilin kan nedregleras eller tas bort helt.
Vi studerade även genen kielin och koncentrerade oss här på att hitta var i den multicellulära organismen som genen uttrycks. Detta gjordes med hjälp av fluorescerande in situ hybridisering, en teknik som går ut på att mRNAt och asRNAt detekteras med hjälp av självlysande komplementära bitar som fäster till mRNAt eller asRNAt i organismen. Vi studerade så kallade slugs, en struktur som uppkommer efter 16 timmar av utveckling, och resultatet visade att mRNA finns i hela strukturen medan asRNAt finns i spetsen/framänden på strukturen.
RNAi är ett hett område inom den molekylärbiologiska och medicinska forskningen idag där ökad kunskap inom detta område skulle kunna leda till att man lär sig kontrollera exempelvis sjukdomsalstrande gener och gener som orsakar cancer. Man skulle alltså teoretiskt sett kunna stänga av en cancerframkallande gen och därigenom se till att cancer inte bryter ut och att man slipper de långa och påfrestande behandlingar som finns. RNAi används redan inom andra tillämpningsområden inom biologi och molekylärbiologi, och därigenom hjälper oss att lösa en del av livets gåtor.