Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Endogenous retroviruses (ERVs) were discovered in the 1960s and in their complete form they consist of two LTRs (long terminal repeat sequences) that are each located on either side of the chain/element. ERVs contain the following genes: gag, pro, pol and env .Ccomplete ERVs are 8-10 kb long and have their best fitness in the enzyme that use reverse transciptase polymerase from single stranded RNA as template to produce DNA and in the possibility the host is not damaged lethally and no selection against the ERV element come into force. When a retrovirus infects a germ cell, the retrovirus inserts its genome into the infected cell and become a part of the entire genome. These ERVs are inherited according to Mendelian expectations in the same way as all other genes in the genome. The phenomenon of ERV inheritance is called vertical contagion. The first exogenous retroviruses that infected a germ cell and became endogenous could have appeared at any time over an extended evolutionary time-scale between 2 to 70 million years ago. Even a horisontal contagion is possible, from one species to another through exogenous retrovirus infection. A possible way of horisontal contagion is when animals of different species are forced to live in a limited area. On average it has been estimated that it takes one million year until retroviral integration is fixed within a population.

All veterbrates have endogenous retroviruses in their genomes, the ERV elements are mostly old, truncated and non-functional. Still some of them have open reading frames in RV gene are low in LTR divergence and in frequency of nonsense mutation causing premature stop of translation and frame shift mutations. The canine genome has been effective in protection from extensive retroviruses integration, the amount in dog is expected to be a fifth of the real ERV amount in species like human and chimpanzees.

Syftet med min studie var att på molekylär nivå söka, klassificera och analysera hundens
endogena retrovirus, CFERV med programmet RetroTector©. Från dessa data har
komplexiteten av hundens ERV definierats inklusive dess proteiner. Kedjor och dess
proteinsekvenser har jämförts med andra individer från samma art eller mellan individer från
olika arter. Av hundens retrovirus insamlades alla kedjor över 300 poäng, av det
bioinformatiska datorprogrammet, RetroTector©. Kopior och L1-liknande element (det är
flera element som liknar retrovirus men inte uppfyller alla krav) sorterades bort. Kopior
återfanns i två nivåer (först på kedjenivå, sedan på polputein-nivå) på grund av att
överlappade kedjor används i programmet för att inte riskera att missa något element. Kopior
plockades bort med hjälp av (i RetroTector©) kända positioner i början och slutet av kedjor
och pol-puteiner. L1-liknande element plockades bort med hjälp av Rep Base Finds
funktionen i RetroTector©. Efter rensning återstod endast 254 unika sekvenser, med gränsen
satt till minst 300 poäng och med den nödvändiga pol-genen av hundens retrovirus, CFERV,
vilka analyserades vidare. Analysen resulterade i 237 gamma-retrovirus, 14 beta-retrovirus, 2
deltalika retrovirus och en spuma-retrovirus. Distributionen av ingående gener i
retroviruselementen är normalfördelade med viss skevhet. De flesta (43 %) retroviruselement
har tre gener, (en pol gen och två andra). En stor skillnad mellan hundens beta- och gammakedjor
är att bland betakedjorna finns inte en enda kedja med endast en pol-gen till skillnad
från Gamma-kedjorna, där uppgår antalet kedjor med en enda pol-gen till 21 stycken (11 %).
Mängden av högpoängs CFERV som återfanns i denna studie var 254 stycken vilket utgör
0,075 % av hundens genom på ca 2,3 miljarder baspar. Många av hundens 254 retrovirus
liknar varandra och överensstämmer väl med retrovirus i andra djurarter HERVFH21 hos
människa och 18 stycken HERVF-lika sekvenser i hund visar genom alignment i Clustal W
på ett gemensamt ursprung. HERVF i människa och i gamla världens primater är en tidig
ERV, kanske 60 miljoner år men HERVF upptäckes sent.
Endogena retrovirus kan smitta, liksom övrigt virus, horisontellt mellan arter som lever nära
varandra. Det kan ske genom articifiella barriärer då olika arter tvingas leva på en mycket
begränsad yta, som mellan olika arter i en djurpark eller som mellan människa och hennes
husdjur. Hunden lever kanske lika nära människan som människor lever nära varandra, därför
tros hund och människa ha gemensamma ERV som HERVF vilket bekräftas av denna studie.
Horisontell smitta kan även förekomma genom predation, från byte till rovdjur liksom till människa som äter kött av andra ryggradsdjur. Endogena retrovirus skiljer sig från exogena
retrovirus genom att de är införlivade i genomet och ärvs ner på mendelsk väg, liksom de
övriga generna. Det är den andra vägen för ”smitta” ERV förs vidare vertikalt genom arvet,
från förälder till avkomma. Det är endast när ett retrovirus infekterar en könscell och blir en
del av genomet som retroviruset blir endogent. ERV kan ses som ett minne av en tidigare
infektion. Om retroviruset inte stör värden alltför mycket, det vill säga om värden kan
överleva och fortplanta sig med viruset intakt och heller ingen selektion sker emot viruset,
kan det efter cirka minst en million år bli fullständigt befäst i en art. Endogent retrovirus är en
nukleotid-kedja som är 9-12 kb lång. För att uppfylla kriteriet retrovirus ska kedjan innehålla
två LTR:er (en i varje ände) och helst de fyra generna gag, pro, pol och env. Dessa gener
kodar för retrovirusets (protein). Ett retrovirus ser ut som följer: 5’ änden börjar med en
5’LTR, en cap som motsvarar den första nukleotiden i det mRNA som bildas, vidare en PBS
vilken startar syntes genom att binda till tRNA. tRNA:ts aminosyra ger namn åt aktuell ERV,
HERVF har tRNA med phenylanalin. Efter PBS kommer de fyra speciella generna: gag, pro,
pol och env, som är avgörande för retrovirusets funktion. Gag kodar för strukturproteinen,
matrix, capsid och nucleocapsid. Pro kodar för proteas. Pol kodar för ett integras och för
omvänt transkriptas som möjliggör omvänd transkription (RNA till DNA), vilket är en
absolut förutsättning för framgång för virus. Env kodar för struktur proteiner för retrovirusets
yta/vägg och dess transportproteiner genom väggen. I 3’ änden efter env-genen avslutas
kedjan med en LTR. Endast en dryg femtedel (22 %) av alla hundens endogena retrovirus är
kompletta med alla de fyra generna. I denna studie har gränsen satts för minst en pol gen för
att kvalificera som retrovirus och för möjlighet att jämföra pol sekvenser. Pol-genen har en
särställning genom sin höga konservering över långa evolutionära tider och sin stabila
proteinsekvens (mer stabil än motsvarande nukleotidkedja). Därför är det Pol-sekvenserna
som används i alla fylogenetiska jämförelser inom hund och mellan hund och andra arter. De,
från allra första början, identiska LTR:en som ”inhägnar” retroviruset kan användas som ett
mått på virusets ålder. Det sker mutationer, insertioner och deletioner över tiden i all
avsmassa, med hjälp av känd mutationshastighet och mätning av skillnaden (divergence)
mellan de båda LTR:en kan ett mått på retroviruselementets ålder erhållas. Denna analys har
inte utförts och beräknats i denna studie.
Hundens genom CanFam2.0 blev fullständigt kartlagt på Broad Institute MIT & Harvard och
publicerades i december 2005 (Lindblad-Toh et al., 2005). Hundsekvensen anges som en
högkvalitativ sekvens och den annoteras och förbättras fortlöpande. Den senaste tillgängliga
versionen är, CanFam2crt10v070313 vilken har används i denna studie. Hundens retrovirus
är inte beskrivet på ett utförligt sätt i litteraturen. Hunden och kycklingen har skyddat sig väl
emot retrovirus jämfört med människa och schimpans.