Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Syftet med DCM-projektet är att hitta en genetisk koppling till hjärtsjukdomen dilaterad cardiomyopati (DCM) hos hundar av rasen Newfoundland. Den del som presenteras i denna rapport innefattar en utvärdering av DNA från paraffininbäddad vävnad och en kandidatgensundersökning där association mellan genen desmin och sjukdomen DCM utvärderas.

DCM är en hjärtsjukdom som drabbar bland annat hundar och människor. Hjärtmuskeln blir förstorad eftersom hjärtat blir utvidgat och orkar inte pumpa ordentligt. Infektion kan vara en orsak till utveckling av DCM, men även andra orsaker finns. Sjukdomen kan i vissa fall ärvas och hos människa har man sett att det är en heterogen sjukdom med flera kända orsakande gener. Hos hund är sjukdomen homogen inom en ras och detta tillsammans med att stora regioner i hundens genom nedärvs tillsammans, vilket kallas "linkage disequilibrium" (LD), gör att de passar bra för genetiska studier. Markörer i genomet jämförs mellan individer för att se vilka regioner som är lika i olika individer.

Vävnad inbäddad i paraffin renades från paraffin och sedan extraherades DNA. För att utvärdera kvalitén på DNA gjordes olika tester i PCR utan eller med ytterligare reningssteg såsom fenol/kloroform-rening och spinkolonner. Alla tester resulterade i att kvalitén på DNA från paraffininbäddad vävnad inte är så bra och att det är stor skillnad mellan olika klossar. Dock fanns inget tydligt samband mellan vilka klossar som gav bra eller dåligt DNA, men en möjlig förklaring kan vara att det gått olika lång tid från det att vävnaden tagits från en patient tills det att den bäddats in i paraffin. Kvalitén var ändå tillräckligt bra för att amplifiera en del fragment med mikrosatelliter, som är repetitioner i genomet som används som genetiska markörer. Markörerna låg runt genen desmin och genom att jämföra markörerna i sjuka och friska hundar kunde ingen association mellan genen och sjukdomen hittas. Dock utgjordes haplotypen endast av två markörer varav en som inte var så informativ, d.v.s. det var samma allel i de flesta individerna. En ny studie med kortare fragment med mikrosatelliter eller andra DNA-prover skulle behöva göras.

Dilated cardiomyopathy, DCM, affects both dogs and humans, and environmental
factors, individual status and genetic causes are known or suspected. DCM is a heart
disease where the cardiac muscle increases in size (hypertrophy), as the heart gets
dilated and systolic (contractile) pressure decrease. The ineffective contraction is the
fundamental defect in DCM. Inherited DCM in humans is a heterogeneous disease
with many known causative genes. These known genes can be used as candidate
genes for DCM in other species, for example the dog. The inherited variant of DCM
in dog appears to be homogeneous within a breed and together with high linkage
disequilibrium (LD), which means that large genomic regions are inherited together,
dogs are preferable to use in genetic studies. Markers in the genome are compared
between individuals to see which regions are shared between individuals.
The overall aim with the DCM project is to determine the genetic association with
DCM in Newfoundland dogs. The study reported here is a part of the DCM project
and includes an evaluation of genomic DNA from paraffin-embedded tissue for use in
genetic studies and a candidate gene approach where association between desmin and
DCM was evaluated.
Genomic DNA extracted from paraffin-embedded tissue was tested in PCR with
and without additional purification steps. All tests indicated that the quality varied
between different paraffin blocks and that most samples contained highly degraded
genomic DNA. The genomic DNA could still be used to amplify fragments including
microsatellites around desmin from several individuals. Only with two of the
microsatellites, fragments were amplified in sufficient number of individuals and the
desmin haplotype therefore only consists of two markers separated by 15.4 kb. One of
these markers was in addition uninformative (95 % of the tested alleles had the same
length). This means that the results should be considered with caution, but they
indicated no association between a desmin haplotype and the disease.