Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

The purpose of this study was to develop a reliable molecular-genetic method to determine the different species of helicobacter in dogs. The study is part of a larger project to map the prevalence of Helicobacter spp in healthy and sick dogs in Sweden, and to determine the possible connection of Helicobacter spp infection with gastrointestinal diseases in dogs.

Several published studies have reported on the prevalence of Helicobacter spp in dogs. The problem is that three of the most common species are so alike that a 16SrRNA-PCR with sequencing is not able to differentiate between them. In this study, DNA has been purified from samples and then a Multiplex PCR has been performed. Multiplex PCRs use multiple primers in one single PCR. The primers have been attached with fluorescent markers, and capillary electrophoresis is used to illustrate the results. In this way, very similar species can be differentiated from each other.

This paper also includes a short review of previous studies made in this field and the different methods used for diagnosis of infection with Helicobacter spp.

Samples from 17 dogs were collected and analyzed. Multiplex PCR was used on 12 healthy dogs. For the Multiplex PCR non-invasivly collected samples were used, namely faeces and mouth swabs. The remaining 5 dogs were patients with different gastrointestinal problems. From these dogs, in addition to faeces and mouth swab samples, biopsies were taken from the stomach and duodenum.

The study shows that the Multiplex PCR works well, but that the capillary electrophoresis is not able to illustrate the results. Also, all samples from all dogs were analyzed in a helicobacteria-specific 16SrRNA PCR and this showed Helicobacter spp in nearly all samples, the frequency of mixed helicobacter-infection being as common in mouth swabs as it was in faeces samples. This unexpected result further emphasises the need to develop the Multiplex PCR-technology, as normal sequencing cannot be used in severe mixed infections. Thus, the Multiplex PCR should prove to be a diagnostically reliable method, but further development and testing are needed.

Syftet med denna studie var att utveckla en molekylärgenetiskt pålitlig metod för att
artbestämma helicobacterbakterier hos hund. Studien är en del av ett större projekt där man
avser kartlägga helicobacterförekomsten hos friska och sjuka hundar i Sverige samt undersöka
bakteriens betydelse för uppkomsten av gastrointestinala sjukdomar hos hund.
Ett flertal studier har rapporterat om förekomst av Helicobacter spp hos hundar, men ett stort
problem är att de allra vanligaste arterna är så pass lika varandra att en vanlig 16S rRNA-PCR
(Polymerase Chain Reaktion) med sekvensering ej kan skilja dem åt. Detta arbete beskriver
hur DNA har renats fram från provmaterial varpå en Multiplex-PCR metod med multipla
primrar tillämpats i en enda PCR-reaktion. Dessa primrar innehåller fluorescerande ämnen
som kan åskådliggöras med hjälp av kapillärelektrofores. Härigenom kan arter som liknar
varann skiljas åt. Arbetet ger även en kort inblick i tidigare studier som gjorts inom området,
samt de olika metoder som finns för diagnos av infektion med Helicobacter spp.
Prov från 17 hundar analyserades och Multiplex-PCR utfördes på 12 friska hundar. Till
Multiplex-PCR-reaktionen användes icke-invasivt tagna prover, faecesprov samt
munskrapprov. De övriga fem hundarna var patienthundar som inkom till kliniken för olika
gastrointestinala störningar. Från dessa hundar analyserades, förutom faeces- och
munskrapprov, även biopsier från magsäck och duodenum.
Resultaten visar att Multiplex-PCR-reaktionen fungerar bra men att kapillärelektroforesen ej
kan åskådliggöra resultatet. Sammanfattningsvis kommer Multiplex-PCR vara en diagnostiskt
pålitlig metod men vidare utveckling och studier krävs. Samtliga prover från samtliga hundar
analyserades i en helicobacterspecifik 16S rRNA PCR och det visade sig finnas Helicobacter
spp hos nästan alla de hundar som provtogs. Dessutom var frekvensen blandinfektion i
munprov liknande den som ses i faecesprov, vilket ej var förväntat. Detta accentuerar
ytterligare behovet av att utveckla Multiplex-PCR metoden då vanlig sekvensering inte kan
användas vid kraftiga blandinfektioner.