Epsilon Archive for Student Projects

Abstract

Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances (PFASs) is a large family of highly fluorinated chemicals, used in different commercial products (e.g. in clothing, shampoos, kitchenware and fire-fighting foams) utilizing their different properties, and have been found in wildlife, humans and in the environment. According to several temporal trend studies, PFNA (perfluorononanoic acid) seems to increase in concentration in the general population and in the environment. PFNA is closely related to the more well-known PFOA (perfluorooctanoic acid), a substance with known reproductive toxicity, but studies regarding PFNAs full toxicological potential effects, especially developmental toxicity, are limited. The aim of this study was to examine the early effects of PFNA exposure on oocytes during in vitro maturation. Using an in vitro model, a controlled environment is established where individual chemicals can be tested without the usage of laboratory animals. Regarding oocyte maturation and initial embryo development, the bovine model is a better model for humans, compared to the murine model.
In this study a bovine in vitro embryo production model was used. Abattoir-derived bovine ovaries were used to collect cumulus oocyte complexes (n = 440). Half of these were matured in vitro under PFNA exposure (0.1 µg/ml) followed by in vitro fertilization and culture, as for the control group. The used concentration was based on a previous study where PFNA was measured in follicle fluid of women (0.4 (0.2-2.1) ng/ml). A margin of safety and the short time of exposure in this study are the reasons for the raised concentration compared to the measured values in the follicle fluid.
Oocyte and embryo development were assessed regarding cumulus expansion, cleavage rate 44h post fertilization and day 7 and 8 blastocyst development and morphology. Day 8 blastocysts were stained with Mitotracker Orange (visualizes active mitochondria) and fixed in paraformaldehyde, followed by additional staining with nuclear stain DRAQ5 and lipid stain LipidTOX. For analysis of the embryos a confocal laser scanning microscope was used. The embryos were evaluated concerning number of nuclei, distribution of mitochondria, lipid droplet morphology and lipid pixel intensity. Statistical analyses were performed by linear mixed models and generalized linear mixed models, with replicate as random factor and observations on day 7 and 8 as repeated measures.
A total of 440 oocytes from 8 batches were included to in vitro maturation, resulting in 88 blastocysts. No significant difference between treated and control group was seen regarding cumulus expansion, cleavage rate, blastocyst development day 7 and 8, quality grade of blastocysts, stage of blastocysts, number of nuclei, mitochondrial distribution scoring or mean lipid pixel intensity. However, there was a significant difference in lipid droplet distribution score between treated and control group (p = 0.048), suggesting an increase in blastocyst lipid content due to the PFNA exposure. It is difficult to know exactly what effect this change in lipid expression has on further embryo development and more studies are needed to investigate this.

Poly- och perfluorerade alkylsyror (PFASs) är en stor familj bestående av högfluorerade kemikalier som används i en mängd olika kommersiella produkter (t.ex. i kläder, schampo, köksredskap och brandskum) där deras olika egenskaper utnyttjas. Dessa syntetiska ämnen har kunnat uppmätas i människa, djur, natur och i vår vardagsmiljö. PFNA (perfluorononansyra) är en substans vars förekomst och koncentration i den genomgående populationen och miljön tycks öka enligt tidstrend studier. PFNA är närbesläktad till PFOA (perfluoroktansyra) som är en mer välkänd och studerad substans med känd reproduktionstoxicitet. Det finns mycket få studier om PFNAs fulla potentiella toxikologiska effekter, särskilt på fosterutvecklingen. Syftet med denna studie var att undersöka vilka effekter exponering av PFNA under oocytmognaden in vitro har på tidig embryoutveckling. Användandet av en in vitro modell möjliggör en kontrollerad miljö där enskilda kemikalier kan testas utan att en stor mängd försöksdjur behöver nyttjas. Nötmodellen, till skillnad från musmodellen, är en bättre modell för människor avseende oocytmognad och tidig embryonal utveckling.
I denna studie användes en in vitro-modell av nöt för framställning av embryon. Nötäggstockar från slakteri användes för att samla in cumulus-oocyt-komplex (n = 440). Hälften av dessa fick mogna in vitro med exponering av PFNA (0.1 µg/ml) följt av in vitro fertilisering och odling, precis som kontrollgruppen. Den använda koncentrationen av PFNA baserades på uppmätta koncentrationer i follikelvätska hos kvinnor (0.4 (0.2-2.1) ng/ml) i en studie av Petro et al. (2014). En pålagd säkerhetsmarginal samt den korta exponeringstiden i denna studie är anledningen till att den använda dosen är högre jämfört med de uppmätta värdena i follikelvätskan.
Oocyternas och embryonas utveckling utvärderades avseende expandering av cumuluscellerna, klyvningskvot 44h efter fertilisering samt blastocystutveckling och morfologi på dag 7 och 8. Dag 8-blastocyster färgades med Mitotracker Orange (färgar in aktiva mitokondrier) och fixerades i paraformaldehyd följt av ytterligare färgning med kärnfärgen DRAQ5 och lipidfärgen LipidTOX. Analysering av embryona gjordes med hjälp av konfokal laser scanning mikroskop. Embryona utvärderades med avseende på kärnantal, fördelning av mitokondrier, morfologi på lipiddroppar och lipidfärgens pixelintensitet. Statistiska analyser utfördes med linjära mixade modeller och generaliserade mixade modeller, med replikat som slumpmässig faktor och observationer från dag 7 och 8 som upprepade mätningar.
Totalt 440 oocyter från 8 batcher genomgick in vitro mognad vilket resulterade i 88 blastocyster. Ingen signifikant skillnad mellan behandlad grupp och kontrollgrupp kunde ses avseende expandering av cumulusceller, klyvningskvot, blastocystutveckling dag 7 och dag 8, kvalitetsgradering på blastocysterna, blastocyststadie, kärnantal, gradering av mitokondriefördelning eller medelpixelintensitet på lipider. Gällande storleksfördelning på lipiddropparna var det en signifikant skillnad mellan behandlad och kontrollgrupp (p = 0.048) vilket tyder på en möjlig ökning av lipidinnehållet i blastocyster efter exponering för PFNA. Det är svårt att veta exakt vilken effekt denna ändring i lipidstatus har på embryots fortsatta utveckling och ytterligare studier behövs för att utreda detta.